M1/M2型巨噬细胞在尖锐湿疣皮损中的表达

刘 睿 孙 弦 胡 珍 吴 庭 曹育春 彭才智

尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)是一种好发于泌尿生殖器皮肤黏膜部位的增生性性传播疾病，是由人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起，常用治疗包括CO2激光、液氮冷冻、光动力、药物等，但其治疗后容易复发，是临床中面临的一大难题[1]。有研究表明，尖锐湿疣治疗后复发的根本原因是HPV感染后营造了局部免疫抑制的微环境，使其逃避了机体免疫系统的清除，进而引起尖锐湿疣的反复发作[2]。在人体皮肤黏膜抗HPV感染的免疫过程中，巨噬细胞发挥了重要作用，它属于一类髓性的自然免疫细胞，可通过吞噬病毒颗粒、释放细胞因子等方式抑制病毒感染而产生抗病毒效应。在不同的局部微环境中，巨噬细胞的功能表型可发生不同的极化，其中最常见的两种极化形式为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞[3]。在肿瘤的相关研究中发现，在肿瘤实体和间质组织中有较多肿瘤相关性巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)，多表现为M2型巨噬细胞样功能表型，可以促进肿瘤的发生和恶性进展等，不利于肿瘤的预后[4]。临床上尖锐湿疣皮损组织的生长模式类似肿瘤组织，已经有研究发现[5]，尖锐湿疣组织内有较多的巨噬细胞，而不同表型的巨噬细胞浸润情况及其对尖锐湿疣复发的影响尚不清楚。本文通过检测尖锐湿疣组织中诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)+巨噬细胞(M1型)、CD163+巨噬细胞(M2型)的浸润情况，以探讨其对尖锐湿疣免疫逃逸的影响。

1 材料与方法

1.1 病例资料 尖锐湿疣标本取自武汉市第三医院皮肤科2017年1月至2018年1月的30例门诊患者，均经组织病理确诊为尖锐湿疣。其中男21例，女9例；年龄16～53岁，平均26.5岁；病程1～6个月。所有患者就诊前1个月均未接受任何治疗，均无其他皮肤病及系统免疫疾病。对照组15例正常皮肤组织来自色素痣整形手术切除后遗弃的正常皮肤组织。CA标本和正常组织的获取，均已得到患者的知情同意。

1.2 主要试剂 即用型鼠抗人CD163单克隆抗体、即用型鼠抗人iNOS单克隆抗体、即用型免疫组化Elivision-plus 试剂盒(鼠|兔)、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 标本处理及免疫组织化学染色 所有标本获得后在10%中性福尔马林溶液中固定24小时，石蜡包埋，4 μm连续切片，行免疫组织化学染色。石蜡切片脱蜡，水化，柠檬酸高压修复抗原，按试剂盒说明书进行操作，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。用已知的阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 CD163、iNOS主要表达于巨噬细胞的细胞膜或细胞质，以细胞质或细胞膜出现棕黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞。首先低倍镜(×100)观察每张切片的阳性细胞密集区，然后每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，计数阳性细胞，取平均值，15天后再用上述方法计数阳性细胞，两次结果的平均值作为最后统计结果。

1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行数据分析，实验结果以均数±标准差表示。采用t检验、Pearson线性相关分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 M1/M2型巨噬细胞在尖锐湿疣和正常组织中浸润情况 iNOS+M1型巨噬细胞在CA皮损组织中数量为(6.16±3.32)/HP，正常组织中数量为(6.76±0.87)/HP(图1)；CD163+M2型巨噬细胞在CA皮损组织中数量为(22.30±6.27)/HP，正常组织中数量为(9.81±4.23)/HP(图2)。在CA皮损组织中，iNOS+M1型巨噬细胞的浸润与正常组织相比，差异无统计学意义(P>0.05)；而CD163+M2型巨噬细胞的浸润与正常组织相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 iNOS+M1型巨噬细胞在CA组织(1a)和正常组织(1b)中的浸润(SP，×400)图2 CD163+M2型巨噬细胞在CA组织(2a)和正常组织(2b)中的浸润(SP，×400)

2.2 M1/M2型巨噬细胞在尖锐湿疣组织浸润的相关性 在CA组织中，CD163+M2型巨噬细胞浸润明显增多的同时，iNOS+M1型巨噬细胞的浸润减少，经Pearson统计学处理，二者呈负相关性(r=-0.905，P<0.05)(图3)。

图3 iNOS+M1型和CD163+M2型巨噬细胞在CA组织中的浸润呈负相关(直线为计算出的回归直线)

3 讨论

巨噬细胞是机体一类重要的髓性天然免疫细胞，主要通过吞噬作用及分泌细胞因子、致炎因子、活性氧化物等，参与机体的天然免疫和获得性免疫过程。巨噬细胞的可塑性和异质性很强，效仿Th1/Th2细胞的分型方式，可将巨噬细胞极端的分为两大类：经典活化的M1型巨噬细胞和选择性活化的M2型巨噬细胞[6]。在微环境中干扰素(interferon，IFN)-γ)或/和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)的诱导刺激下，巨噬细胞可极化为经典活化的M1型，其主要参与Th1细胞免疫反应，发挥针对胞内微生物的免疫清除、抗肿瘤作用及宿主免疫功能等；而在微环境中白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-13或IL-10、糖皮质激素等的诱导刺激下，巨噬细胞可极化为选择性活化的M2型，其在机体肿瘤生长及免疫调节方面发挥重要作用，参与肿瘤的生长、侵袭，促进血管、淋巴管生成以及抑制T细胞和自然杀伤细胞的免疫活性[6，7]。M1型巨噬细胞高表达HLA-DR、iNOS等，而M2型巨噬细胞高表达清道夫(如CD163)、甘露糖(如CD206)等表面受体以及精氨酸酶(arginase，ARG)1，低表达iNOS酶[7，8]。其中，iNOS酶主要由M1型巨噬细胞合成分泌，催化L-精氨酸产生NO和L-瓜氨酸，NO参与机体炎症反应、杀灭微生物及抗肿瘤过程，可作为M1型巨噬细胞的标记物[8]。CD163属于富含半胱氨酸的清道夫受体膜蛋白家族，主要表达于单核巨噬细胞系的表面，可以结合血红蛋白-珠蛋白复合物，从而将血红蛋白摄入单核-巨噬细胞中参与代谢，多被用来标记M2型巨噬细胞[8，9]。

本研究选用iNOS作为M1型巨噬细胞的标记，CD163作为M2型巨噬细胞的标记，进行免疫组织化学染色。免疫组织化学结果显示，尖锐湿疣皮损组织中M1型巨噬细胞的浸润数量较正常组织无明显差异，而M2型巨噬细胞数量明显多于正常组织，且M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的浸润呈负相关，说明随着M2型巨噬细胞的浸润增多，M1型巨噬细胞浸润随之减少。该研究结果初步证实了尖锐湿疣皮损组织中有较多的M2型巨噬细胞浸润，即M2型巨噬细胞在尖锐湿疣局部免疫中处于优势，结合M2型巨噬细胞具有负向免疫调节作用，故其可能在尖锐湿疣皮损组织局部免疫逃逸过程中发挥了重要作用。而对于尖锐湿疣组织中的巨噬细胞如何转变为M2型巨噬细胞的机制，目前还不完全清楚。已经有研究证实，CD4+CD25+调节性T细胞可以影响巨噬细胞表型及功能的变化[10]，而尖锐湿疣皮损组织中存在较多的CD4+CD25+调节性T细胞[5]。故我们推测尖锐湿疣皮损中的CD4+CD25+调节性T细胞可能参与了巨噬细胞表型转化过程，这需要进一步研究去证实。