实时、同体监测岭南火针对带状疱疹后遗神经痛模型大鼠外周神经递质的影响及其时效性

李晶晶, 周鹏, 曾婧纯, 裴文娅, 林国华

(1.深圳市宝安中医院(集团)∥广州中医药大学附属宝安中医院，广东 深圳 518133;2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405)

带状疱疹后遗神经痛继发于带状疱疹1个月以上的神经疼痛性疾病，以刀割样、放电样、灼烧样、针刺样疼痛为多见，可伴有痛、触觉过敏及局部皮肤感觉异常等症状，针灸治疗对该病有较好的疗效.岭南火针是广州中医药大学第一附属医院林国华教授在临床上常用的中医适宜技术之一，2017年荣获广东省非物质文化遗产称号.岭南火针采用材质钨锰合金制成，具有硬度高、质韧，耐热、耐腐蚀等特性，针尖较传统火针锐利挺直，是结合岭南地区患病特征及古代中医文化优势所形成的针灸特色疗法，关于岭南火针的首次记载是《幼幼集成》采用火针治疗小儿谷道不通.岭南火针具有“温”“通”“补”“清”“消”5大功效[1].重视“通运温调”“借火助阳”[2]是岭南火针与传统火针最大的不同之处，其局备“火郁发之、以热引热”的特性，擅长治疗顽疾痛症、内科疾病及皮肤科疾病.本课题在以往研究的基础上，将探索领域拓展至其他领域，对比不同治疗方法对带状疱疹后遗神经痛外周肌肉组织中腺苷及其代谢产物的变化，为岭南火针治疗带状疱疹后遗神经痛提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

(2)实验器材 精密微量进样泵MD-1001、精密微量进样泵控制器MD-1000、线性探针LM-10(美国BASi公司)；1 mL微量进样器(美国Hamilton公司)；0.18 mm×25.00 mm不锈钢针灸针(环球针灸器械有限公司)；细岭南火针(定制)；韩氏穴位神经刺激仪(HANS-200A).

(3)实验药品及试剂 腺苷标准品(美国Sigma公司，A9251)；ADP标准品(美国Sigma公司，A7699)；甲醇、乙腈(天津四友精细化学品有限公司)；磷酸二氢钾AR、四丁基硫酸氢铵AR、氢氧化钾(天津致远化学试剂有限公司)；复方氯化钠注射液(四川科伦药业有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

实验共使用32只大鼠，分为正常对照组(不造模，不治疗)；模型对照组(大鼠造模，不治疗)；电针治疗组(大鼠造模，予以电针治疗)；岭南火针治疗组(大鼠造模，予以岭南火针治疗)，各组8只大鼠，共32只大鼠.

1.2.2 带状疱疹后遗神经痛模型制备[3-4]

将CV-1细胞(非洲绿猴肾母纤维细胞)加入DMEM/F12完全培养基中制成细胞悬液，依照5.0×104/cm2接种于培养瓶，再用VZV感染CV-1细胞，当80% CV-1细胞被感染时即可收集并制作细胞悬液，进行带状疱疹病毒接种.将SD大鼠置于湿度、温度适中的SPF实验环境中，造模前，用体积分数为4%的水合氯醛麻醉SD大鼠，于SD大鼠右足蹼底部皮下注射体积为50 μL病毒接种溶液.感染后第4天大鼠开始出现热痛敏阈值和机械痛敏阈值降低可判定造模成功.

1.2.3 治疗方案

(1)模型对照组 使用记号笔在治疗腧穴处做定位标记，局部皮肤常规消毒，操作者使用0.18 mm×25.00 mm 1次性无菌针灸针刺入SD大鼠阳陵泉(右)、昆仑(右)，深度约4.00 mm，留针30 min后出针.

(2)电针治疗组 局部皮肤标记常规消毒，操作者使用0.18 mm×25.00 mm 1次性无菌针灸针刺入SD大鼠阳陵泉(右)、昆仑(右)，深度约4.00 mm，连接韩氏穴位刺激仪，疏密波 2/100 Hz,治疗30 min后出针.

(3)岭南火针治疗组 局部皮肤标记常规消毒，操作者使用特制细岭南火针在酒精灯上充分燃烧至白亮，迅速刺入大鼠阳陵泉(右)、昆仑(右)，深度约1 mm，速进速出，每穴点刺3次，以上操作重复3遍.

1.2.4 实验流程

造模成功后第4天，剃除实验大鼠右下肢及背部毛发并固定于束鼠器中，拉伸右下肢并暴露充分，局部常规消毒后，在右下肢胫骨前缘安装微透析线性探针，连接微透析系统，设定流速为1.0 μL/min，平衡灌流30 min后，以开始收集第1管外周组织液作为治疗前30 min样品，每组大鼠分别予以火针、普通针刺、电针治疗后30、60、90、120 min 4个干预时间段组织液样品收集体积各30 μL，透析结束后，将收集完成的透析液使用高效液相色谱法进行检测样品内腺苷及其代谢产物质量浓度，不能立即检测的样品放入-80 ℃冰箱保存.

1.2.5 统计分析

2 结果

2.1 各组大鼠外周组织腺苷质量浓度的变化

造模后，各组大鼠外周组织内腺苷质量浓度降低，与正常组对比有统计学差异(P<0.01).治疗后30～60 min，电针组局部腺苷质量浓度接近基线水平，与模型组相比有统计学差异(P<0.01).治疗后90 min，该组大鼠局部腺苷质量浓度下降至模型组水平，无统计学差异(P>0.05)；岭南火针组大鼠局部腺苷在治疗后60 min开始逐步接近基线水平，与模型对照组相比有统计学差异(P<0.01)，治疗后120 min仍维持在高水平状态.90～120 min，岭南火针组外周组织中腺苷质量浓度明显高于电针组，有显著统计学差异(P<0.01，表1，图1).

组别n治疗前治疗后30 min治疗后60 min治疗后90 min治疗后120 min正常对照组842.2±14.6847.73±12.1249.86±14.5843.37±16.2450.76±16.67模型对照组810.12±1.641)9.90±2.031)11.28±1.421)10.27±2.221)9.09±1.081)电针治疗组810.43±1.611)47.05±12.932),3)33.88±12.881),3)12.03±1.121),4)11.29±2.591),4)岭南火针组89.06±1.431)19.59±10.51),5),6)32.06±10.671),3),7)49.60±17.872),3),6)40.13±16.872),3),6)

与正常组比较：1)P<0.01； 2)P>0.05；与模型组比较：3)P<0.01；4)P>0.05； 5)P<0.05；与电针组比较：6)P<0.01； 7)P>0.05.

A.正常对照组腺苷浓度变化；B.模型对照组腺苷浓度变化；C.岭南火针组腺苷浓度变化；D.电针组腺苷浓度变化.

A．The levels of adenosine in normal group；B. The levels of adenosine in model control group; C. The levels of adenosine in Lingnan fire needle group; D. The levels of adenosine in electro-acupuncture group.

图1 各组大鼠治疗前后不同时间段外周组织腺苷浓度的变化

Fig.1 Comparison of the level of adenosine at various time points before and after treatment of rats

3.1 各组大鼠外周组织AMP质量浓度的变化

造模后，组大鼠外周组织内AMP质量浓度降低，与正常组对比极具统计学差异(P<0.01).治疗后30 min，两治疗组AMP升高，电针组AMP质量浓度明显提高，与正常组无统计学差异(P>0.05).治疗后60 min，电针组、岭南火针组AMP质量浓度与正常对照组无明显差异(P>0.05)，质量浓度维持在高水平.治疗后90 min，电针组AMP质量浓度回落至低水平状态，与模型对照组无统计学差异(P>0.05)，与正常组极具显著性差异(P<0.01).而岭南火针治疗组在治疗后120 min仍保持在基线水平，与正常对照组无明显差异(P>0.05).治疗后90 min，岭南火针组AMP质量浓度水平较电针组低(P<0.01)，90～120 min，岭南火针组外周组织中AMP质量浓度明显高于电针组，具有显著统计学差异(P<0.01).结果显示，电针在治疗后30 min即能够起到镇痛效应，岭南火针在治疗后60 min起效，且至少维持2 h(表2，图2).

组别n治疗前治疗后30 min治疗后60 min治疗后90 min治疗后120 min正常对照组89.57±2.2210.08±1.2310.39±1.7110.08±1.419.48±1.63 模型对照组83.30±0.751)3.18±0.751)2.59±1.001)3.35±0.961)3.13±0.711)电针治疗组83.12±0.951)10.74±2.292),3)9.54±1.852),3)3.17±0.761),4)2.80±1.591),4)岭南火针组82.73±0.941)5.36±3.191),5),6)9.51±3.152),3),7)10.55±3.652),3),6)9.08±3.002),3),6)

与正常组比较：1)P<0.01； 2)P>0.05；与模型组比较：3)P<0.01； 4)P>0.05；5)P<0.05；与电针组比较：6)P<0.01；7)P>0.05.

A.正常对照组AMP浓度变化；B.模型对照组AMP浓度变化；C.岭南火针组AMP浓度变化；D.电针组AMP浓度变化.

A．The levels of AMP in normal group；B. The levels of AMP in model control group; C. The levels of AMP in Lingnan fire needle group; D. The levels of AMP in electro-acupuncture group.

图2 各组大鼠治疗前后不同时间段外周组织AMP质量浓度的变化

Fig.2 Comparison of the level of AMP at various time points before and after treatment of rats

3.2 各组大鼠外周组织ADP质量浓度的变化

造模后，组大鼠外周组织内ADP质量浓度降低，与正常组对比极具统计学差异(P<0.01).治疗后30 min，岭南火针组和电针组局部ADP质量浓度接近正常对照组，与模型组比较极具显著性差异(P<0.01)，治疗后60～120 min，岭南火针组局部ADP质量浓度均接近正常对照组，而电针组于治疗后60 min开始下降，与模型对照组无统计学差异(P>0.05)，90～120 min阶段，岭南火针组外周组织中ADP质量浓度明显高于电针组，具有显著统计学差异(P<0.01，表3，图3).

表3各组大鼠治疗前后不同时间段外周组织ADP质量浓度的变化
Table3ComparisonofthelevelofADPatvarioustimepointsbeforeandaftertreatmentofrats

组别n治疗前治疗后30 min治疗后60 min治疗后90 min治疗后120 min正常对照组827.30±11.9328.01±11.0024.53±7.3027.57±10.0434.48±10.03 模型对照组812.02±2.331)10.52±4.911)8.64±2.461)10.11±3.141)10.91±2.691)电针治疗组89.97±2.481)22.98±6.222),3)18.60±9.322),3)14.70±6.811),4)14.57±6.371),4)岭南火针组89.28±3.101)22.86±5.882),3),6)22.72±8.782),3),6)31.39±9.242),3),5)30.72±5.612),3),5)

与正常组比较：1)P<0.01； 2)P>0.05；与模型组比较：3)P<0.01；4)P>0.05；与电针组比较：5)P<0.01；6)P>0.05.

A.正常对照组ADP浓度变化；B.模型对照组ADP浓度变化；C.岭南火针组ADP浓度变化；D.电针组ADP浓度变化.

A．The levels of ADP in normal group；B. The levels of ADP in model control group; C. The levels of ADP in Lingnan fire needle group; D. The levels of ADP in electro-acupuncture group.

图3 各组大鼠治疗前后不同时间段外周组织ADP质量浓度的变化

Fig.3 Comparison of the level of ADP at various time points before and after treatment of rats

3 讨论

带状疱疹是皮肤科常见病，其后遗神经痛是带状疱疹常见的并发症[6]，部分患者在皮损出现同时或完全消退后，仍遗留针刺样、烧灼样、电击样、搏动样、放电样疼痛，严重者持续时间长达数月或者数年，年长者较多发[7-8]，且其疼痛程度与年龄呈正相关.目前，口服或外用西药在带状疱疹的治疗中并不能有效防治后遗神经痛，运用尚存在一定的局限性[9-10].带状疱疹在古代医籍中属于“蛇串疮”范畴，在岭南地区比较高发，其病因病机为肝胆湿热，湿热郁久化滞，壅塞腠理，痰瘀互结，阻滞经络则发为顽痛，迁延日久损伤阴津阳气，正虚邪实.蛇串疮发作初期，热毒湿盛，邪气嚣张跋扈，异性寒凉之品难以攻伐，常常损兵折将，寒伏其邪，正气反虚，久之伤津耗气；岭南火针性情与火毒相近，能够窃入热毒深处，无突攻之势而邪不自醒，以热引热，使热有道可循，火邪通过孔道而外泄，毒气随火气而升散，拔毒邪外出，与此同时，岭南火针具有温经通络、扶阳祛邪、升阳透疹之功，体内正气通过孔道外出与邪交争，由表透邪，营卫调和，瘀散痰化，阴平阳秘，正胜邪去，故能生肌敛疮，去腐排脓，内外通彻则愈[11].

岭南火针是具有岭南特色的中医适宜技术，岭南滨海地区气候潮湿，日照时间长，常年气温偏高，“湿热”“痰湿”“热郁”为患病特点，皮肤病是岭南地区高发疾病，岭南火针“火郁发之” “以热引热”的作用[11]，可用于岭南地区温热潮湿环境下所产生的皮肤顽疾,岭南火针的热刺激可促进局部炎症组织水肿、渗出、增生等病理变化，改善局部血液循环，增强机体的细胞与体液免疫功能，促进代谢与细胞修复.还可以通过调节外周、中枢的神经递质如五羟色胺、阿片类、肾上腺素、腺苷在外周及中枢神经系统的质量浓度，从而起到镇痛作用.

腺苷(adenosine)是生物体内生命活动赖以生存的物质之一，它与不同数量的磷酸结合形成一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，腺苷既是合成前体又是过程代谢产物.在20世纪70年代，细胞内ATP被认为是维持细胞生命的重要物质，此后又有研究表明，被释放出细胞外的ATP及其代谢产物成为神经递质，参与了痛觉传导和调控.在中枢及周围神经系统都广泛存在.连同腺苷受体被称作“嘌呤能受体”，嘌呤能受体与阿尔兹海默病、癫痫、神经病理性疼痛关系密切.它们种类各异，参与了痛觉的调控过程.嘌呤能受体分为P1受体和P1受体两大类，P1受体有A1、A2A、A2B、A34个亚型，其中A1、A2B受体具有保护神经和降低疼痛级别的作用；A2A受体能够刺激神经元兴奋，加剧组织损伤；A3受体保护、损伤作用共存[12].外周组织中疼痛信息的传递受神经营养及其他因素的影响[13].

在中枢系统中，慢性神经病理性疼痛产生于神经元与周围的神经胶质细胞之间的嘌呤能信号互动[14].

研究表明，造模后大鼠局部组织腺苷及其代谢产物质量浓度明显减少，痛阈降低，予以相应强度电刺激后，本处于低水平的腺苷、AMP、ADP、ATP又接近其基线，连续动态观察以上指标，此效应可维持60 min都处于高质量浓度状态[15].在本课题组以往的研究中，同样使用微透析技术对3种不同干预方式对类风湿性关节炎关节炎模型大鼠进行观察，结果显示，传统针刺、岭南火针、均能够在一定时间内提高ADP、ATP、腺苷水平，传统针刺和岭南火针在针刺即时能够出现提升效应，而岭南火针的镇痛效应可维持至2 h，与其他两组相比具有作用时间长、起效快等优势[16-17].基于本课题以往的研究，继续深入分析岭南火针与电针两种刺激方式对神经性疼痛的影响.

本课题研究结果显示，造模后，各组大鼠外周组织内腺苷、AMP、ADP质量浓度降低，治疗后30～60 min，电针组局部腺苷、AMP质量浓度接近基线水平，治疗后90 min，该组大鼠局部腺苷、AMP和ADP质量浓度逐渐下降至模型组水平.岭南火针组镇痛效果起效时间在30～60 min，治疗后120 min，外周组织中腺苷、AMP、ADP仍处于基线状态，与正常对照组无明显差异，治疗后90～120 min阶段，岭南火针组外周组织中腺苷质量浓度明显高于电针组.结果显示，电针在治疗后30 min即能够起到镇痛效应，岭南火针在治疗后60 min起效，且至少维持2 h，岭南火针较电针组而言，具有镇痛效果持久的优点.

微透析技术在针灸科研领域应用较少，监测指标和技术尚存限制，此课题暂未对模型大鼠病变局部腺苷及其代谢产物的质量浓度进行长时间在线监测，将来的课题设计可进一步优化，克服技术难点进行长时效动态观察，以便对岭南火针的延时效应进行更深入的探讨.