不同浓度复方夏枯草制剂对人非小细胞肺癌细胞移植裸鼠的瘤体生长影响及机制探讨

韦云妮，杨斌，梁丽莉，张梦师，许艺龄，王柳萍

(1广西医科大学药学院，南宁 530021；2广西中医药大学)

中国最新癌症数据显示，肺癌仍是各类癌症之首，癌症防治已是人们关注的重点对象[1～3]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中的一种主要类型[4]，且由于发现较晚以及医疗技术水平的限制，加大了肺癌的医治难度和复发风险[5]。复方夏枯草制剂由夏枯草、淫羊藿等制成。夏枯草味辛，性寒，常用于软坚散结、消肿、抗肿瘤等[6,7]，其机制主要与肿瘤细胞增殖受到抑制、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导分化、抗氧化、免疫调节、逆转肿瘤耐药等因素有关[8]。淫羊藿味甘，性温和，活性成分活跃，其不仅能阻滞前列腺癌细胞肿瘤生长、侵袭和迁移，还能使黑色素B16肿瘤细胞发生凋亡[9～11]。本课题组成员在前期实验发现，由夏枯草、西红花、胆南星、龙血竭、冰糖草等组成的依癌胶囊对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞裸鼠移植瘤有抑制作用，且不良反应小[12]。除此之外，关于淫羊藿和夏枯草对人肺癌H460细胞的影响，至今仍无详细的研究报道。2015年11月～2018年3月,本研究观察了不同浓度复方夏枯草制剂对NCI-H460细胞移植裸鼠瘤体生长的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级裸鼠(BALB/c)36只，雄性，3～5周龄，购于湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司[许可证号码：SCXK(湘)2016-0002]。

1.2 药物、试剂及仪器 复方夏枯草制剂中的中药材由北海天洄生物技术有限公司提供，本课题组制成复方夏枯草制剂，取处方中的淫羊藿、夏枯草等4味药材，粉碎成粗粉，加入十倍量水进行煎煮，提取3次，1 h/次，合并3次煎煮液滤过，减压浓缩至每毫升含2 mg生药，4 ℃保存备用；环磷酰胺(CTX，百特医疗用品贸易有限公司)。考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物工程研究所)。洁净净化工作台(苏州净化设备总厂)，二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，十万分之一电子天平[梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司]。

1.3 NCI-H460细胞培养 超净工作台经紫外照射30 min后将NCI-H460细胞置于含有配好培养液(由RPMI1640培养基、GIBCO血清、双抗青链霉素按90∶10∶1的比例混合而成)的培养瓶中，于细胞房37 ℃、5%CO2的恒温培养箱里培养，并每天润洗换液。

1.4 裸鼠移植瘤模型制备、分组及复方夏枯草制剂灌胃 超净工作台经紫外照台30 min后，用0.25的胰蛋白酶消化细胞，按照文献方法进行操作。在SPF环境下，碘伏消毒裸鼠右后肢皮肤表面，取医院常用的1 mL注射器吸0.2 mL的NCI-H460细胞悬液注射到裸鼠右后肢皮下，注射完毕后用棉签轻轻按压30 s，接种完毕后继续在SPF环境下饲养，并在每天固定时间范围内观察记录裸鼠活动、精神、生存及瘤体生长情况。肿瘤体积长到60～80 mm3的30只裸鼠分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性组、模型组各6只，另取6只正常裸鼠作为对照组，高剂量组、中剂量组、低剂量组分别以2.4、1.2、0.6 g/kg的复方夏枯草制剂灌胃，阳性组注射0.025 g/kg的CTX，对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水；阳性组隔两天给药1次，其他组每天1次。

1.5 裸鼠一般情况观察及瘤体积测量和瘤重、药物抑瘤率计算 在给药期间，每天固定时间范围内观察并记录已接种细胞的裸鼠生存质量、精神状态、行为饮食及肿瘤生长情况。给药结束次日，在处死裸鼠之前先将裸鼠称重并用游标卡尺测量移植瘤的近似大小，再用镊子和小剪刀小心完整剥离取出移植瘤，迅速剔除血块、脂肪、肿瘤包膜及坏死组织，生理盐水冲洗，然后拿吸水纸吸去残余水分，于万分之电子称调零之后称取瘤体的重量，随后用小剪刀把瘤体分成两块，分别放到-80 ℃冰箱里冻存和固定在装有4多聚甲醛的离心管里，待用。计算肿瘤体积，抑瘤率(IR)=(1-实验组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%；计算抑瘤率，抑瘤率=(1-复方夏枯草制剂组平均肿瘤体积/模型组平均肿瘤体积)×100%，有标准规定中药医治肿瘤其抑瘤率>30%被视为有效。

1.6 瘤组织病理形态学观察 参照文献[13]方法，于光学显微镜下观察肿瘤的生长情况和坏死程度等。

1.7 瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3检测 采用免疫组化法。按照试剂盒说明书的实验步骤进行操作，将组织切片脱蜡至水修复、孵育，血清封闭，加一抗、二抗，DAB显色，苏木精染色，酒精分化，水洗返蓝，中性树胶封片，镜检。结果判断标准：若被着色为黄色则发生阳性反应，Bcl-2、Bax、Caspase主要是胞质呈阳性。随机取5个视野在200倍光镜下观察，并计算呈阳性细胞的百分比，取其平均值。

2 结果

2.1 各组裸鼠一般情况比较 与模型组相比，给药组裸鼠的精神，行为活动、食欲均无明显异常，瘤体生长缓慢；CTX组形体消瘦，体质量减轻，精神萎靡，瘤体积较模型组小。各组给药前后瘤体积及肿瘤体积比较见表1。高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组、阳性组抑瘤率分别为43.9%、21.5%、13.0%、0、71.7%。

表1 各组给药前后瘤体积及瘤重比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

2.2 各组瘤组织病理形态比较 各组瘤组织均为细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。模型组癌细胞紧密，核仁体积大；阳性组和复方夏枯草制剂低、中、高剂量组细胞有不同程度坏死，癌细胞数目明显减少，且大小不一，胞质破裂，完整性不好。

2.3 各组瘤组织Bcl-2、Bax、Caspase-3阳性率比较 结果见表2。

表2 各组瘤组织Bcl-2、Bax、Caspase-3阳性率比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

癌症的发病率和病死率随着环境污染的急速加剧而逐渐升高，尽管人类的医学水平在科技高速发展的今天有了很大提高，但是每年死于癌症的人数还是高得惊人，因此征服恶性肿瘤已成为全世界人们的迫切愿望，也成为各医务工作人员最紧要的任务[14]。肺癌在所有恶性肿瘤的病死率中占据首位，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

复方夏枯草制剂由夏枯草、淫羊藿等极具特色的中草药通过水提取法、蒸馏、浓缩制成。夏枯草味辛，性寒，常用于软坚散结、消肿、抗肿瘤等[6,7]；当前，夏枯草无论是在抗癌方面，还是在机制研究方面，都有大量的文献记载，其机制主要与肿瘤细胞增殖受到抑制、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导分化、抗氧化、免疫调节、逆转肿瘤耐药等因素有关[8]。目前，对于夏枯草的研究汇集在体外，对于体内研究较少。淫羊藿味甘，性温和，活性成分活跃，尤其是淫羊藿苷成分，近年来在抗肿瘤的研究中获得显著进展[9]。有文献[10,11]报道，淫羊藿苷不仅能阻滞前列腺癌细胞的生长、侵袭和迁移，还能使黑色素B16肿瘤细胞发生凋亡。本研究显示，与模型组比较，高剂量组、阳性组给药后瘤体积、瘤重减小。模型组癌细胞紧密，核仁体积大；阳性组和复方夏枯草制剂低、中、高剂量组细胞有不同程度坏死，癌细胞数目明显减少，且大小不一，胞质破裂，完整性不好。提示复方夏枯草制剂能抑制NCI-H460细胞裸鼠移植瘤生长，高剂量浓度效果最好。

细胞凋亡中有多种基因蛋白参与，并主要由内、外源性两种途径发生，其内途径又是细胞发生凋亡的主要途径，与线粒体紧密相关，而线粒体的内外膜间腔中含有Caspase、Bax、Bcl-2等多种涉及细胞凋亡的因子[15]。Caspase家族能够诱导多种蛋白酶系统发生凋亡，在凋亡途径中起主导作用并能汇集多条凋亡途径，致使肿瘤细胞执行最终凋亡命名[16]。若Caspase家族被激活，细胞内的蛋白质将被依次慢慢降解，从而致使凋亡的肿瘤细胞不再有复活的可能[17]。Caspase家族中的Caspase-3通过酶切下游底物，直接执行细胞凋亡，Bcl-2家族能够在线粒体途径中主要调节控制调亡因子释放，其中Bcl-2家族中的相关蛋白Bax能促使线粒体上通透转运孔道的开放，从而Caspase蛋白被激活，诱导细胞调亡[18～20]。Bcl-2家族根据功能的差异主要分为两种蛋白(抗凋亡和促凋亡)，其中抗凋亡蛋白有Bcl-2、Bcl-xL，促凋亡蛋白研究最多的有Bax、Bcl-Xs、Bad。Bcl-2家族能够在彼此间构成二聚体形式相互调节对方细胞生与死[21,22]。本研究显示，与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性组Bax阳性率升高，高剂量组、中剂量组、阳性组Caspase-3阳性率升高。提示中高剂量组复方夏枯草制剂是直接通过上调Bax、Caspase-3表达促使肿瘤细胞发生凋亡。

总之，高剂量复方夏枯草制剂能抑制NCI-H460细胞移植裸鼠瘤体的生长，其作用机制可能是通过上调Bax、Caspase-3表达。