蠲痹汤调控淋巴管回流功能治疗膝骨关节炎的研究＊

易南星，王晓赟，梁倩倩，王拥军，韩海慧，王艺儒，马迎辉，施 杞，，4，张 霆，，徐 浩＊＊

（1.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2.上海中医药大学脊柱病研究所 上海 200032；3.上海中医药大学附属光华医院 上海 200052；4.教育部重点实验室（筋骨理论与治法）上海 200032）

膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一种慢性进行性关节疾病，病变主要累及患病关节的软骨、软骨下骨、滑膜等，主要病理表现为关节软骨破坏、骨赘形成、滑膜炎症和关节间隙变窄等[1]。该病发病率高，影响着约2.5亿人口，全球大于65岁的人将近一半受此病的影响，且女性多于男性[2,3]。到目前为止,晚期KOA 患者除进行全膝关节置换术外尚缺乏有效的治疗手段，给患者家庭及社会造成了巨大的负担[4]。因此寻找新的KOA治疗靶点和方法具有重要意义。

淋巴系统主要的生理功能是维持机体的体液平衡、免疫监视和胃肠道脂肪酸的吸收，与微循环之间关系密切[5]。近年来，越来越多的研究证实淋巴回流功能在炎症性关节炎发生、发展过程中具有重要作用：①肿瘤坏死因子-转基因（Tumor Necrosis Factor-Transgenic，TNF-Tg）和K/B×N 等慢性炎症性-侵蚀性关节炎小鼠模型出现淋巴回流功能下降[6]；②VEGFR-3中和性抗体特异性抑制淋巴管生成，减少淋巴回流，会加重TNF-Tg 小鼠关节炎症损伤[7]；③在关节局部过表达VEGF-C，促进回流，显著减轻关节炎症损伤[8]。

中医学把KOA 归属于“痹症”、“顽痹”等病证范畴,以肝肾气血亏虚、风寒湿邪气外袭、痰瘀互结、痹阻经络为主要病因病机[9]。痹病“不通则痛”的特点与淋巴管回流功能障碍加重关节炎症的病理表现极为类似。具有“止痹痛”作用的中药通过促进淋巴回流，起到治疗“痹病”的作用。如中药复方独活寄生汤可以改善淋巴回流功能，促进淋巴管生成，减轻关节炎症[10]。中药有效组分阿魏酸抑制肿瘤坏死因子α刺激淋巴管内皮细胞产生的一氧化氮，减轻一氧化氮对淋巴管平滑肌细胞的损伤，改善慢性炎症下的淋巴回流功能，从而减轻关节炎症[11]。三七总皂苷可以刺激淋巴管内皮细胞产生VEGF-C 促进淋巴管生成[12]。本研究将首次从淋巴管角度探讨JBT 对KOA 模型小鼠淋巴管回流功能及疾病进程的影响。

1 材料

1.1 实验动物

10 周龄C57BL 雄性小鼠120 只，体重26 ± 2 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。所有小鼠按体重的大小随机分为3 组：JBT 组、Mobic 组和PBS 组。各组小鼠在相同条件下自由饮水、摄食，由上海中医药大学实验动物中心提供全价颗粒饲料。本研究所有实验均符合上海中医药大学动物伦理委员会规定。

1.2 试剂、仪器

异氟烷（沃瑞德，Batch NO.217140901），脱毛膏（利洁时公司，印度），吲哚菁绿（Acorn），乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA，国药集团化学试剂有限公司，10009617），伊红（Sigma：E4009-5G），苏木素精（sigma，H-3136），艾尔新蓝（sigma，A5268），酸性橙（Sigma，1936-15-8），PBS（Medicago，09-2052-100）。小动物麻醉机（Matrx VMR，美国），近红外成像系 统（Olympus，MVX10），全片扫描仪（Olympus，VS120-SL）。

2 方法

2.1 药物及给药

蠲痹汤药物组成：羌活3 g、独活3 g、秦艽3 g、当归9 g、川芎2.1 g、甘草1.5 g、海风藤6 g、桑枝9 g、乳香2.4 g、木香2.4 g、桂心（后下）1.5 g。所有中药均购自上海中医药大学附属龙华医院中药房。根据《实验动物药理学》，将小鼠（20 g）与人（70 kg）的中药剂量进行换算（换算系数9.01），小鼠需服中药煎剂浓度为0.52 g·mL-1，取上述中药10 付，加12 倍水，浸泡30 min，煮沸后继续煎煮30 min，趁热过滤得煎液1；所余药渣加8 倍水，同样方法得煎液2；合并2 次煎液，通风橱中加热浓缩至770 mL，分装后-80℃保存。JBT 组：小鼠按10 mL/kg/d) 隔日灌胃给药，每次约0.2 mL；Mobic 组：莫比可片7.5 mg，加纯水溶解，灌胃浓度0.022 5 mg·mL-1，隔日灌胃0.2 mL；PBS 组：等体积的PBS 灌胃，隔日灌胃，连续灌胃16周。

2.2 造模方法

所有小鼠右膝均接受DMM 手术以诱导KOA 模型，左膝接受假手术作为对照。具体方法如下：腹腔注射氯胺酮麻醉小鼠（20 mg·kg-1），碘伏酒精消毒小鼠双侧膝关节部位。OA 组：手术刀片在右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧带中间开0.5 cm 切口，显微镜下牵开皮肤及脂肪组织，暴露内侧半月板、内侧半月板胫骨韧带，用显微手术剪贴着胫骨切断内侧半月板胫骨韧带，缝合皮肤切口；Sham 组：左膝关节相同位置开0.5 cm 切口，缝合皮肤切口。术后切口处涂些许新霉素眼膏，放回笼内，等待小鼠苏醒。

2.3 淋巴管回流功能检测

将小鼠置于麻醉机中，异氟烷麻醉后，双下肢脱毛，注意保护小鼠皮肤，将小鼠置于热台上，热台温度保持在28℃，给予小鼠面罩气体麻醉。用微量注射器，30G 针头，吸取10 uL 0.1 g·mL-1浓度的ICG，注射于小鼠膝关节腔。注射后3 h 拍摄膝关节照片，注射后6 h 后再次拍摄膝关节照片，在腘窝淋巴结区域圈定合适区域（Region of Interest，ROI），检测信号亮度。利用软件Image J 对ROI区域分析，得到数据代入固定公式进行计算【clearance=(ROI3h-ROI3hbg)-(ROI6h-ROI6hbg)/(ROI3h-ROI3hbg)，bg：background】，得到的结果是小鼠膝关节ICG清除率，其代表淋巴回流功能。

图1 各组小鼠膝关节ICG的清除情况及结果

2.4 膝关节形态学检测

淋巴管回流功能检测结束后，小鼠脱颈处死并取膝关节，标本在10%福尔马林固定24 h 后，10%EDTA脱钙4 周，每72 h 更换脱钙液1 次，组织脱水，石腊包埋，4 um 矢状位连续切片，进行ABHO 染色及免疫组化染色。Olympus图像采集系统采片。

2.5 统计学方法

统计结果采用均数±标准差（±s）进行描述，应用SPSS 19.0 统计软件，采用单因素方差分析（oneway ANOVA），行LSD 检验。P＜0.05 表示有显著性统计学差异。

3 实验结果

3.1 蠲痹汤对小鼠膝关节淋巴管回流功能的影响

ICG 是一种带负电，具有水溶性的三碳菁染料，ICG 的激发光波长大概是780 nm，吸收光谱波长峰值800-830 nm，这段波长可以被近红外光谱仪检测。注射入皮下后，迅速与组织液中的白蛋白结合为大分子，从而被淋巴管吸收，因此用于淋巴管回流功能的检测。在小鼠膝关节部注射ICG，然后利用近红外仪器分别在注射后3 h 和6 h 检测，与ICG 注射后3 h 相比，ICG 注射6 h 后，膝关节ROI 区域的信号强度均有减弱，PBS 组的信号减弱更慢。与PBS、Mobic 组比较，JBT 组在术后4 周和8 周小鼠膝关节的ICG 清除率均有显著改善（P＜0.05）（图1）。

3.2 各组小鼠膝关节关节软骨ABHO 染色及OARSI评分

ABHO 染色显示，矢状面上，SHAM 组小鼠膝关节关节面覆盖一层蓝染的软骨，软骨表面连续，模型组小鼠股骨与距骨表面的软骨遭到了破坏，蓝染区域表面不完整不连续，区域面积减少，蠲痹汤治疗后，软骨结构有所恢复，蓝染区域面积在前两个时间点优于PBS 组和Mobic 组。随着时间的推移，软骨的面积逐渐减少，术后16周时，关节软骨基本完全被磨损，组间已无明显差异。OARSI 评分中，在术后4 周和8 周，与PBS、Mobic 组比较，JBT 组关节软骨的评分明显改善（P＜0.05），在12周和16周，发现3组之间没有明显差异（图2）。

3.3 蠲痹汤对小鼠膝关节关节软骨II 型胶原含量的影响

II 型胶原免疫组织化学染色显示，矢状面上，SHAM 组小鼠膝关节关节面覆盖一层灰色的软骨，软骨表面连续，模型组小鼠股骨与距骨表面的软骨遭到了破坏，灰染区域表面不完整不连续，区域面积减少，蠲痹汤治疗后，软骨结构磨损的进程减慢，灰染区域面积优于PBS组和Mobic组（图3）。

3.4 蠲痹汤对小鼠膝关节关节软骨Nitege的影响

Nitege 胶原免疫组织化学染色显示，矢状面上，SHAM 组小鼠膝关节关节面覆盖一层完整的软骨，软骨表面连续，模型组小鼠股骨与距骨表面的软骨遭到了破坏，关节周围组织中出现了阳性染色，蠲痹汤治疗后，与PBS组比较，关节软骨中Nitege 含量增加的速度减慢（图4）。

4 讨论

图2 各组小鼠膝关节ABHO染色及OARSI评分

图3 各组小鼠膝关节II型胶原免疫组化染色

本研究首次从关节淋巴管回流功能障碍、淋巴回流不畅角度，探讨膝骨关节炎“风寒湿侵袭，痹阻不通”病机，及蠲痹汤“祛风除湿、蠲痹止痛”功效的科学内涵。研究结果表明，蠲痹汤能够改善KOA 模型小鼠膝关节淋巴管功能、促进淋巴回流、延缓关节软骨退变进程、起到治疗作用。淋巴管是该方治疗膝骨关节炎的作用靶点之一。

我们的前期研究表明，小鼠膝关节周围存在淋巴管网系统，而且淋巴管的回流功能在炎症性关节炎疾病的进程中起着重要的作用[13]。通过抑制慢性炎症动物模型TNF-α转基因模型小鼠淋巴管的回流功能，会加重关节炎的严重程度[14]。而通过按摩促进淋巴管的回流功能会改善全膝关节置换术（total knee arthroplasty，TKA）患者术后病情的恢复[15]。其机制可能是TNF-α引起淋巴管内皮细胞炎性活化，造成炎症因子和炎性细胞的大量释放，抑制了淋巴管平滑肌细胞的增殖，造成淋巴管平滑肌细胞收缩能力下降[16]。而通过手法按摩促进了淋巴管的回流功能。淋巴系统在类风湿性关节炎、哮喘、银霄病等疾病过程中扮演重要角色[17]，而淋巴管回流功能障碍加重炎症性疾病与中医“痹证”中“痹阻不通、不通则痛”的发病机理极为类似[18]。因此，深入研究淋巴管的功能有利于从现代医学的角度对痹证理论进行探讨。

图4 各组小鼠膝关节Nitege免疫组化染色

蠲痹汤治疗痹证由来已久，《杨氏家藏方》卷四：蠲痹汤主治风温相搏，身体烦疼，项臂痛重，举动艰难，及手足冷痹，腰腿沉重，筋脉无力。《重订严氏济生方》中蠲痹汤主治身体烦疼，项背拘急，或痛或重，举动艰难，及手足冷痹，腰腿沉重，筋脉无力。《魏氏家藏方》卷八：气弱当风饮吸，风邪容于外，饮湿停于内，风湿内外相搏，体倦舌麻，甚则恶风多汗，头目昏眩，遍身不仁。《医学心悟》卷三：风寒湿三气合而成痹，蠲痹汤主之。《金鉴》卷三十九：蠲痹汤主治痹病而身寒无热，四肢厥冷。上述蠲痹汤虽治疗主证各有差异，但不外乎风寒湿三邪侵袭人体，造成人体关节经络痹阻不通，瘀而成痹。因此，蠲痹汤是治疗痹证的主方之一。

现代研究表明，蠲痹汤含药血清能够显著降低佐剂性关节炎大鼠外周血中单核细胞肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的表达水平[19]，也可以升高对效应性T细胞和炎性细胞因子分泌具有抑制作用的IL-35 水平，从而改善局部的炎症情况[20]。其内服外洗用法可显著降低关节炎患者血清和关节液中基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的水平而升高金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的水平[21]。蠲痹汤中单体成分阿魏酸可抑制诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达，阻断NO 的产生，从而阻止淋巴管回流功能的下降[22]。有研究表明，蠲痹汤冻干粉可抑制TNF-α诱导淋巴管内皮细胞产生的NO，减轻其对淋巴管平滑肌细胞的损伤，保证淋巴管对炎症因子的回流功能，达到治疗关节炎症的目的。

综上所述，蠲痹汤可通过增强早期KOA 模型小鼠膝关节淋巴管回流功能，减轻炎症因子和炎症细胞在局部的淤积；延缓关节软骨的退变速度，从而起到治疗KOA 的作用。但是膝骨关节炎病因复杂，尤其是在疾病后期，蠲痹汤对淋巴管回流功能的改善远不能达到治愈KOA 的目的，如何明确该方的临床应用证型,是否需要其他方药合理配伍，加减化裁，解决临床多靶点问题，有待于深入研究。