姜黄素对慢性应激大鼠的神经保护作用

邓 莉 耿春梅 廖德华 江 沛 韩文秀

1.山东省济宁市第一人民医院健康管理部，山东济宁 272002；2.山东省济宁市第一人民医院临床药学科，山东济宁 272002；3.湖南省肿瘤医院药学部，湖南长沙 410006

抑郁症是一种以显著而持久的情绪低落、兴趣丧失为主要临床特征的心理障碍疾病。近年来，抑郁症发病率逐年攀升，严重影响人们的生活质量。根据2012 年世界卫生组织报告，预计到2020 年抑郁症将成为人类第二大致残原因，仅次于心血管疾病［1］。研究表明，慢性应激可调节下丘脑-垂体-肾上腺轴，调节神经内分泌，改变神经可塑性及神经凋亡，影响机体的整体稳态机制，进而导致抑郁的发生［2-3］。临床广泛应用的抗抑郁药主要包括三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等。然而其高昂的费用、不可忽视的副作用及滞后的药效，使新型抗抑郁药的研发需求不断升高。近年来，传统中药受到人们的重视。作为姜科姜黄属植物根茎的天然有效成分，姜黄素具有抗炎、抗氧化、免疫调节和神经保护作用［4-6］。此外，姜黄素还能逆转慢性应激引起的大鼠行为、记忆及认知的改变［7-8］，提示其对中枢神经系统的潜在调节作用。本实验采用慢性不可预见性应激（CUMS）模型，探讨姜黄素对慢性应激大鼠的中枢神经保护作用，为预防和早期治疗慢性应激损伤及新型抗抑郁药的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雄性SD 大鼠24 只，2 月龄，体重180～220 g，由湖南省肿瘤医院动物实验中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2018-0003，合格证号：44002700 004389。动物饲养及动物实验方案均遵循国家《实验动物管理条例》执行，并获得了济宁医学院伦理委员会的批准。

1.2 药物与试剂

姜黄素（美国Sigma 公司，生产批号：2142805）；大鼠皮质酮酶联免疫试剂盒（美国Cayman 公司，生产批号：01501320）；BDNF 抗体（美国Abcam 公司，生产批号：GR42954-2）；PSD-95 抗体（美国Proteintech公司，生产批号：00025154）；SYN 抗体（美国Proteintech 公司，生产批号：00049214）；β-actin 抗体（美国Proteintech 公司，生产批号：00045582）；细胞凋亡Tunel 原位检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，生产批号：KGA702-A）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、造模、给药 采用随机数字表法将24 只SD 大鼠随机分为对照组、模型组、治疗组，每组8 只。CUMS 抑郁模型构建参照文献［9］，包括潮湿垫料（24 h）、45°倾斜笼具（24 h）、夹尾（1 min）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、束缚在空水瓶中（4 h）、昼夜颠倒（12 h/12 h）。1 周内每日给予一种不同的应激，共持续4 周。治疗组造模同时每日以100 mg/kg 姜黄素溶液（悬浮于0.5%吐温80）灌胃，对照组和模型组每日以等量生理盐水灌胃。采用行为学实验筛选CUMS 造模成功的大鼠，以糖水偏好性显著下降、不动时间显著增加为造模成功的标准。

1.3.2 糖水偏爱实验 实验步骤参照文献［10］，大鼠单独饲养，笼具两侧各放置1 瓶1%的糖水适应48 h。随后禁水14 h，于笼具两侧放置预先称重的清水和1%糖水各1 瓶供其自由选择。1 h 后再次称重，记录1%糖水和清水消耗量。蔗糖偏好（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+清水消耗量）×100%。

1.3.3 强迫游泳实验 实验步骤参照文献［11］，将大鼠放入高45 cm、直径25 cm、水深35 cm、水温24℃的塑料圆筒中。实验开始前适应性游泳15 min，正式实验时适应1 min，记录5 min 内大鼠的不动时间。

1.3.4 血清皮质酮水平检测 24 只大鼠均于早上8:00～9:00 采集静脉血，4℃，3500 g 离心15 min 分离血清，-80℃冰箱保存备用。按照试剂盒说明书，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清皮质酮水平。

1.3.5 Western blot 分析蛋白表达 大鼠行为学测试后立即处死并置于冰上，分离海马，研磨后提取总蛋白，采用Bradford 法进行蛋白定量。取10 μg 蛋白样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜后，封闭1 h，4℃孵育过夜。抗体浓度：BDNF（1：2000）、PSD-95（1：2000）、SYN（1：1000）、β-actin（1：4000）。TBST 洗膜后二抗孵育1 h，进行ECL 化学发光，使用Image J 软件分析蛋白的相对表达量。

1.3.6 Tunel 染色检测细胞凋亡情况 取大鼠脑组织在含4%多聚甲醛中固定后石蜡包埋，按照试剂盒说明书切片、脱蜡、细胞凋亡染色后置于荧光显微镜下观察，棕褐色为Tunel 染色阳性的凋亡细胞。随机选取切片5 张，每张切片随机选取5 个视野，对阳性细胞进行计数，取平均值计算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡细胞数/（正常细胞数+凋亡细胞数）×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对大鼠行为学的影响

模型组大鼠糖水偏好度显著低于对照组，治疗组大鼠糖水偏好度显著高于模型组（P＜0.01）；模型组大鼠不动时间显著长于对照组，治疗组大鼠不动时间显著短于模型组（P＜0.01）。见图1。

图1 姜黄素对大鼠行为学的影响

2.2 姜黄素对大鼠血清皮质酮水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清皮质酮水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠血清皮质酮水平显著降低（P＜0.01）。见图2。

图2 姜黄素对大鼠血清皮质酮水平的影响

2.3 姜黄素对神经突触可塑性的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马BDNF、PSD-95、SYN 蛋白表达显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠海马BDNF、PSD-95、SYN 蛋白表达显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见图3。

2.4 姜黄素对大鼠神经细胞凋亡的影响

图3 姜黄素对神经突触可塑性的影响

与对照组比较，模型组大鼠组织切片中凋亡阳性细胞个数明显增加，细胞凋亡指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠组织切片中凋亡阳性细胞个数明显减少，细胞凋亡指数显著降低（P＜0.01）。见图4。

3 讨论

应激是抑郁症重要诱发因素，长期慢性应激能够激活HPA 轴，引起体内神经内分泌功能的紊乱［12］。此外，应激参与神经可塑性下降的调节，加速神经元细胞的凋亡，导致抑郁样行为的产生。CUMS 抑郁模型以不同的轻度刺激因子长期刺激动物，模拟人类处于慢性低水平应激下导致的抑郁症。该模型与抑郁症患者的临床表现有一定相似性，被广泛应用于抗抑郁药物的活性筛选和发病机制的探讨。

多项研究表明，姜黄素参与调节多种神经递质和情绪调节相关的细胞内信号通路，具有抗炎、抗氧化、调节神经突触可塑性和细胞凋亡的作用，有很强的抗抑郁潜力［13-15］。此外，临床试验证实，姜黄素能够改善抑郁症患者的抑郁症状［16-19］。在此基础上，本研究构建CUMS 经典抑郁模型，进一步验证姜黄素的抗抑郁作用及相关机制。

本实验结果示，姜黄素治疗后大鼠的糖水偏好度升高，不动时间缩短，CUMS 诱导的大鼠抑郁样行为得到缓解，证明了姜黄素的抗抑郁作用。长期应激导致HPA 轴过度激活，作为应激指标，皮质酮水平被广泛应用于应激状态的评估［20-21］。本研究结果提示，姜黄素能够缓解CUMS 诱导的皮质酮水平升高，这可能与其调节HPA 轴神经活性有关。此外，姜黄素通过参与调节神经可塑性和细胞存活的重要细胞内信号通路，在不同动物模型中表现出保护和逆转认知损伤的作用［22-23］。在创伤性脑损伤大鼠模型中，姜黄素能调节BDNF、cAMP 反应元件结合蛋白等相关蛋白在海马中的表达，减轻大鼠的氧化损伤，使认知功能恢复正常［24-26］。本研究结果显示，姜黄素能够显著提高海马BDNF、PSD-95、SYN 的蛋白表达水平，改善大鼠神经突触可塑性。同时还能降低神经细胞的凋亡率，改善细胞的存活，起到抗抑郁效果。总之，本研究提示姜黄素可能通过调节HPA 轴降低血清皮质酮水平，改善神经突触可塑性及细胞凋亡，达到抗抑郁效果。