间充质干细胞治疗椎间盘退行性变的研究进展

李浪平，杨 娟，熊源长，曲文春*

1.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院麻醉科，上海 200020

2.美国梅奥医学中心物理和康复医学科，明尼苏达州 55905

3.海军军医大学附属长海医院麻醉科，上海 200433

椎间盘退行性变（IDD）是引起下腰痛的主要病因之一［1］，IDD导致的椎间隙狭窄是下腰痛重要发病机制［2-3］。成人椎间盘是人体最大的无血管组织且细胞含量较少［4］。IDD不同于正常衰老，衰老属于生理现象，不引起疼痛，而IDD则会引起髓核细胞（NPC）活性下降、数量减少，椎间隙高度丢失等，从而产生下腰痛。IDD的非手术治疗［5］和手术治疗［6］对短期疼痛缓解有一定的效果，但疼痛复发率较高，手术治疗甚至会加快同一节段或相邻节段椎间盘的退行性变，且均不能从根本上中止或者逆转IDD的发病进程。因此，探索从分子生物学方面阻止甚至逆转IDD的发展进程具有重要的临床意义。近年来，干细胞治疗技术的飞速发展为从根本上治疗IDD带来希望，本文对应用广泛的间充质干细胞（MSCs）治疗IDD的相关研究进行分析，现综述如下。

1 治疗IDD的干细胞来源及分化

与所有干细胞治疗技术一样，干细胞选择至关重要。由于NPC和软骨细胞无论在表型上还是在分子标记物上都很相似，因此，能够分化为软骨细胞的干细胞就是潜在的治疗IDD的干细胞来源，目前主要有MSCs。将MSCs诱导分化为软骨细胞的技术和条件已经较为成熟［7-8］。合适的干细胞来源主要特征：①细胞丰富；②易于获取；③有诱导分化为软骨细胞的能力；④能够在低氧及低血糖的环境下增殖且尽量少甚至没有免疫反应，且同时不会诱导肿瘤细胞生长。动物实验中，MSCs移植可取得与NPC移植相似的结果，MSCs能成功诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经元细胞和内皮细胞［9-10］，目前常用于IDD治疗的干细胞以骨髓间充质干细胞（BMSCs）和脂肪间充质干细胞（AMSCs）为主，另外还有NPC、脐带间充质干细胞（UC-MSCs）及诱导多能干细胞（iPSCs）等。

BMSCs具有很强的自我增殖、多向分化潜能和免疫耐受等特点，而且取材方便，便于得到足够数量的细胞。BMSCs在特定条件下具有向髓核样软骨细胞分化的潜能，并且能表达与NPC所分泌的细胞外基质相似的Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖等优点。2003年，Sakai等［11］首次将BMSCs用于IDD治疗研究，将自体BMSCs联合载体去端肽胶原移植到兔IDD模型中；结果提示，BMSCs移植能减缓兔椎间盘的退行性变，该结果为治疗人类IDD带来了希望。Kim等［12］建立了新西兰白兔MSCs和NPC的共培养体系，以将MSCs诱导分化为髓核样细胞。在没有机械刺激的情况下分组研究MSCs与NPC的最佳比例和机械刺激效应：第1组（MSCs）、第2组（NPC），第3、4、5组（NPC与MSCs的比值分别为1∶1、1∶2和2∶1），培养10 d。结果显示，第5组髓核样细胞增殖较多，MSCs分化程度明显增加；对第1，2和5组增加机械刺激后，可促进MSCs向髓核样细胞的分化，证实了机械刺激对分化的贡献。但骨髓抽取为有创过程，且抽取量也受到一定限制。

AMSCs与BMSCs具有较为相似的生物学特性，它们在生长动力学、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面没有明显差异。AMSCs相较于BMSCs的优势在于来源更广，容易分离和采集，可随时在皮下脂肪组织中提取，容易获得大量有分化潜能的干细胞，相关研究亦证明了对IDD具有改善作用［13-14］，但诱导分化为软骨样细胞的能力还需进一步证实。

UC-MSCs为多能干细胞，无伦理障碍；对于IDD患者，不可能自体取得。

iPSCs来源于体细胞，通过诱导异位重组转录因子（OCT3/4、SOX1/2/3、c/N/L-MYC、KLF2/4、NANOG、和LIN28）的表达而生成，来源于髓核组织的iPSCs可以诱导分化为髓核样软骨细胞，自我更新、增殖、分化能力强；有肿瘤产生的可能。

诱导MSCs向软骨样细胞分化有多种方法。体外实验显示，在特定的培养基中，如低氧以及富含多种诱导刺激因子，如转化生长因子（TGF）-β1、TGF-β3、胰岛素样生长因子（IGF）-1、IGF-2、生长分化因子（GDF）-5和骨形态蛋白（BMP）等，MSCs通过与NPC直接接触后，诱导分化为髓核样细胞［15］。另外，基因治疗已经用于加强MSCs向软骨样细胞分化的过程，如编码软骨细胞分化过程中转录抑制因子SOX-9的SOX-9基因［16］、细胞凋亡抑制剂；原型致癌基因Bcl-2等也用来加快MSCs向软骨样细胞分化的过程［17］。

2 MSCs 在治疗IDD中的应用

2.1 动物实验

研究表明，BMSCs和AMSCs都能分化成髓核样表型细胞，继而产生蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白修复发生退行性变的椎间盘［18-19］。Peroglio等［18］认为，载体HA-pNIPAM的添加能更有效诱导人BMSCs向椎间盘表型分化，培养的细胞中Ⅱ型胶原，SOX-9，细胞角蛋白-19，分化簇24和叉头蛋白F1表达量更高。MSCs植入发生退行性变的椎间盘后，一方面能增殖分化为髓核样细胞，进而诱导合成新的细胞外基质（ECM），增加受累椎间盘的高度和含水量；另一方面，活化的MSCs能分泌多种细胞因子、生长因子，促进椎间盘细胞的生长以及ECM的合成，并起到营养、抗炎以及免疫调节作用，从而改善内环境，缓解临床症状。多项动物实验通过采用不同的评价指标与安慰剂组相比较均证实了MSCs治疗IDD的疗效。Freeman等［20］在羊模型中对比研究了3组发生退行性变的椎间盘环形缺损修复效果；结果发现，相较对照组，MSCs治疗组在造模术后3 ～ 6个月有明显修复。在兔IDD模型中，交联透明质酸（XHA）支架负荷MSCs可以促进椎间盘再生［21］。从解剖学角度评价，MSCs组的椎间盘高度和椎间盘高度指数明显增加［13，22-23］；从组织学角度评价，MSCs组NPC及含水量增加，MRI T2WI信号增强代表椎间盘含水量增加［13，23-24］。尽管各研究间数据存在不同程度差异，但总体结果仍显示MSCs移植能减慢、中止甚至逆转椎间盘的退行性变过程［25］。Jin等［26］利用TGF-β3与AMSCs联合培养，产生比单纯AMSCs更加明显的椎间盘样细胞和ECM表达产物。在兔IDD模型中SOX-9基因转录入BMSCs后可以明显提高其对发生退行性变的椎间盘的修复。除了基因干预外，某些物理方法，如轴向牵引也可促进兔发生退行性变的椎间盘再生，其机制在于轴向牵引可以增加局部的水分和营养［27］。

一项系统综述纳入了24项动物实验研究，对862个椎间盘进行了MSCs注射治疗；结果显示，所有来源的MSCs都成功地抑制了IDD的发展，在大部分动物模型中椎间盘高度都明显提高，其中BMSCs的抑制作用最明显［28］。Wang等［29］报道的一项关于干细胞治疗IDD的Meta分析，共纳入22个动物实验研究项目（包含9项随机对照试验），其中17项研究选择的干细胞为BMSCs，5项为AMSCs；结果显示，MSCs治疗组椎间盘高度指数升高、MRI T2WI信号强度增强、Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达增加、组织学水平的IDD级别下降；认为干细胞移植能有效缓解或阻止四足动物的IDD过程。从大量动物实验结果看，MSCs对IDD具有一定治疗效果，但后续需要更多的大样本随机对照研究以进一步评判疗效。

2.2 临床试验

Kumar等［30］进行了为期12个月的单组Ⅰ期临床试验，共入选10例疼痛持续＞ 3个月、疼痛视觉模拟量表（VAS）评分＞4分、Oswestry功能障碍指数（ODI）≥30%的下腰痛患者，分别向低剂量（2×107个细胞，n=5）组和高剂量（4×107个细胞，n=5）组患者椎间盘内注射透明质酸（HA）载体联合AMSC。随访1年结果发现，低剂量组和高剂量组各3例患者VAS评分、ODI和生活质量量表（SF-36）评分显著改善，2组间差异无统计学意义。6例有显著改善的患者中，3例MRI显示椎间盘含水量增加。

Noriega等［31］报道的随机对照研究中，将24例经非手术治疗无效的IDD慢性腰痛患者随机分为2组。试验组在局麻下向椎间盘内注射同种异体BMSCs，对照组采用椎旁肌肉组织的假性浸润。随访1年结果显示，与对照组相比，经BMSCs治疗的患者疼痛及生活质量明显改善，MRI检查示椎间盘明显改善。Mochida等［32］的研究纳入9例20 ～ 29岁患者，IDD Pfirrmann分级3级，在行融合术时取出NPC和自体BMSCs共培养1周后再用1×106激活的NPC重新移植入融合节段邻近椎间盘；随访3年，JOA评分从术前（14.2±4.8）分改善至（27.2±1.6）分；MRI未见移植的椎间盘有不良现象；所有病例均无下腰痛；说明以上治疗可延缓IDD进程。Pettine等［33］的一项开放性临床试验共入选26例患者，采用自体BMSCs治疗IDD，随访12个月，患者疼痛明显减轻、椎间盘脱水程度改善且无明显不良反应。Orozco等［34］共纳入下腰痛患者10例，采用自体BMSCs治疗，随访1年发现患者VAS评分和ODI均明显改善（有效率为71%），在治疗3个月时改善最为明显（有效率为85%），椎间盘含水量明显增加，疗效与脊柱融合术或椎间盘置换术相当。

总结以上5项关于干细胞治疗IDD安全性及有效性的临床试验，通过评估其安全性和耐受性、VAS评分或数字评分法（NRS）、ODI及MRI，结果显示，临床试验结果中均无明显并发症发生、治疗组的疼痛明显减轻、功能明显改善、MRI显示治疗后椎间盘含水量明显增加。

近年，关于UC-MSCs在IDD中的应用潜力也受到越来越多的关注，体内和体外试验均证明了这一类干细胞的增殖分化能力，并发现其移植到人体椎间盘后能有效缓解疼痛［35］。目前MSCs治疗IDD还处于亚临床试验阶段，大部分研究的病例数还很少，干细胞来源主要是自体MSCs。也许随着技术的成熟，将会有更多的临床试验研究逐渐开展。

3 MSCs用于治疗IDD的机制及潜在风险

IDD与促炎性细胞因子（如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）大量释放有关。而MSCs之所以能有效改善IDD与其能调节炎性反应有关。MSCs通过分泌保护因子，如细胞因子和趋化因子，起到抗炎及免疫调节的作用。有研究发现，当在体外用IL-1β刺激时，NPC由炎性介导的退行性变指数明显增加，而当NPC和BMSCs一起共培养时，NPC的退行性变和凋亡指数明显下降，而且IL-1β刺激的NPC会明显吸引和介导BMSCs的迁移。这说明在IDD中BMSCs可以发挥抗凋亡效应，并且可以被炎性反应刺激后的NPC介导向病变部位迁移［36］。一项随机对照的兔IDD模型研究也认为，MSCs可以延缓椎间盘高度指数下降的原因是MSCs可以抑制凋亡［23］。Cao等［37］发现当BMSCs与NPC共培养时可以明显延缓NPC的基质发生退行性变，其机制是上调TGF-β同时抑制NF-κB信号通路的表达。MSCs植入后微环境发生变化，移植部位NPC之间的相互作用机制决定了MSCs的转归。最近的研究发现，外泌体是BMSCs和NPC之间传递生物信息的重要载体，外泌体自身或通过携带基因或药物可能可以有效用于治疗IDD［38］。

干细胞治疗IDD有一定的作用，但也有潜在风险［25］：①细胞泄漏引起椎管内骨赘形成，继而造成椎管狭窄。②干细胞移植涉及的椎间盘面积更大，可能发生感染的概率增高。③干细胞的多能性诱导肿瘤发生。为了减少细胞泄漏的发生，可使用细胞载体，如去端胶原肽凝胶、水凝胶、透明质酸凝胶等，胶原微球支架可以明显减少注射后骨赘形成［39］。合适的载体除了可以防止细胞渗漏到椎管，还可以给细胞提供一个有效的增殖分化环境，因此，加强细胞载体的研究很有必要。为防止椎间盘感染或椎间盘炎的发生，严格管理细胞培养、无菌手术操作至关重要。另外，建议患者术前常规使用抗生素。尽管MSCs是否会导致肿瘤的发生目前还存在争议，但是这种潜在的可能性需要被重视。因目前还没有办法做到免疫监测，如果MSCs需要较长的增殖期，染色体稳定性势必会降低，肿瘤的发生概率就可能增加。研究发现，使用患者的血清或者血小板裂解液来缩短细胞培养时间，可以降低染色体不稳定的风险。

4 结语和展望

IDD会引起椎间盘高度降低、NPC含量减少。动物研究表明，MSCs通过增殖分化为软骨细胞后，能有效修复发生退行性变的椎间盘；增殖分化后的软骨样细胞能合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白形成ECM，它们同时还能调整椎间盘的内环境。由于BMSCs及AMSCs安全、免疫耐受，是目前研究和治疗IDD的最佳干细胞。但MSCs治疗IDD仍然存在一些风险，细胞载体的选择、移植技术的改进及无菌操作技术等能一定程度降低风险。从现有的研究来看，MSCs用于临床治疗IDD具有可行性，有望逆转IDD的病程，但需要更多的基础与临床研究来评估其安全性和有效性。干细胞移植后如何适应新的微环境并继续增殖分化为NPC是未来需要解决的问题，有待进一步研究探索。