牦牛乳中乳链菌肽产生菌的定向筛选及抗菌活性研究

郝 刚，唐善虎，李思宁

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

乳酸菌广泛分布于土壤、水、肥料、动物、植物及其制品中[1]，主要有乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、粪肠球菌(Enterococcusfa ecolis)和柠檬酸链球菌(Streptococcusci trovorus)等.乳链菌肽(Nisin)是由乳酸乳球菌亚种产生的一种多肽类细菌素，可以抑制革兰氏阳性菌的生长[2-4].

Nisin是目前研究最多、应用较广且唯一用于商业化生产的细菌素，已被广泛应用于乳制品、罐头食品、高蛋白食品的防腐保鲜，是一种高效无毒的天然食品防腐剂[5].近几年，一些研究者已经从新鲜牛奶、市售辣白菜、自制泡菜、实验室保存的干酪粉中成功分离出了Nisin产生菌[6].新鲜牛乳含有多种营养成分，其营养比例非常适合微生物生长繁殖.牛乳刚离开健康奶牛的乳房时不应有乳酸菌，但由于环境中的乳酸菌从乳头侵入乳管之故[7]，可检出这类微生物.牦牛乳是一种天然的“浓缩乳”[8]，由于牦牛生活在高海拔地区致使牦牛乳中微生物菌系区别与一般的牛乳.目前，关于牦牛乳中乳链菌肽产生菌的定向筛选方面的研究还未见报道.本研究以红原牦牛乳为原料，采用选择培养基定向筛选，GM17培养基富集并结合抑菌圈法筛选乳链菌肽产生菌，辅之生理生化指标鉴定及PCR技术检测其16SrDNA保守序列，并通过滤纸片扩散法筛选抑菌作用较强的菌株，为探明牦牛乳微生物区系及牦牛乳的综合利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

藤黄微球菌(Micrococcus flovus)ATCC4698、埃希氏大肠杆菌(Escherich coli)JM109、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)50013、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)6538，以上菌株由西南民族大学食品科学实验室保存;牦牛鲜乳(红原本地牧场);Nisin标准品(≥1000 IU/mg)(上海Aladdin公司);X-gal、IPTG(北京拜尔迪生物技术有限公司);柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司);pGEM-T Easy Vector system 1试剂盒，3S Spin试剂盒(上海沪宇生物科技有限公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、氢氧化钠、氯化钠、苯酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠、无水乙醇、氯化钙、甘油、革兰氏染色液、过氧化氢(科龙化工试剂厂).

GM17基本培养基：蛋白胨(Peptone)1.0%(W/V)，葡萄糖(Glucose)0.5%(W/V)，酵母膏(Yeast extract)0.5%(W/V)，牛肉膏(Beef extract)0.25%(W/V)，抗坏血酸 0.05%(W/V)，MgSO4·7H2O 0.001%(W/V)，Na2HPO41.9%(W/V); 选择培养基：蛋白胨(Peptone)1.0%(W/V)，蔗糖(Sucrose)1.0%(W/V)，酵母膏(Yeast extract)0.5%(W/V)，牛肉膏(Beef extract)0.25%(W/V)，抗坏血酸0.05%(W/V)，MgSO4·7H2O 0.001%(W/V)，Na2HPO41.9%(W/V)，溴甲酚紫(Bromocresol purple)0.004%(W/V)， 琼脂(Agar)1.6%(W/V)，在使用前加入50IU/mL乳链菌肽;S1培养基：胰蛋白胨(Tryptone)0.8%(W/V)，酵母膏(Yeast extract)0.5%(W/V)，葡萄糖(Glucose)0.5%(W/V)，NaCl 0.5%(W/V)，Na2HPO41.0%(W/V)，固体培养基添加1.6%琼脂;LB培养基：蛋白胨(peptone)1.0%(W/V)，酵母膏(yeast extract)0.5%(W/V)， NaCl 1.0%(W/V)，pH值7.6～7.8，固体培养基添加1.6%琼脂.

1.2 试验仪器

德国Eppendorf公司冷冻离心机(美国UVP有限公司);Mini电泳槽(美国Bio-Rad公司);DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂);凝胶成像分析仪pro2000(美国MJ公司);DY-A电泳仪(上海西巴斯生物技术开发公司).

1.3 试验方法

1.3.1 乳链菌肽产生菌的定向筛选

将新鲜牦牛奶样品以10%接种量接种于含有1000 IU/mL Nisin的GM17培养基中，30℃增殖培养18 h.将增殖培养液接种到涂有50 IU/mL Nisin的选择培养基上，30℃培养24 h.挑取周边培养基变黄的菌落，富集培养后，再次在选择培养基上划线分离单菌落，直至筛选平板的菌落呈均一性状.将纯化的单菌落转接于含有1000 IU/mL Nisin的GM17培养基中培养过夜，菌液离心后取其上清液待用.

将S1固体培养基高温灭菌，冷却至50～60℃，按1%的接种量，接种S1液体培养基过夜培养的藤黄微球菌，混匀后倒平板，放置约1 h，再倒置于4℃冰箱中1 h.用灭菌的镊子将直径为4～6 mm的滤纸片均匀地摆放在培养基表面上，在滤纸片上滴加10 μL的GM17培养液的上清液[9].在其他滤纸片上分别滴加10 μL的乳链菌肽(4 000 IU/mL)和卡那霉素作为对照.平板置于30℃培养过夜，观察抑菌圈的大小.1.3.2 乳链菌肽产生菌生理生化指标鉴定

筛选到的待测菌株斜面培养20 h后，分别对其进行革兰氏染色镜检，乙酰甲基甲醇试验(V·P试验)，过氧化氢酶试验(接触酶试验)，葡萄糖发酵试验，45℃生长试验，4%NaCl生长试验[10].

1.3.3 乳链菌肽产生菌16S rDNA鉴定

(1)乳链菌肽产生菌特异性16S rDNA的PCR扩增

将培养至对数生长期的待测菌株收集，柱式抽提试剂盒提取基因组DNA.根据乳酸乳球菌16SrDNA的保守序列[11]，合成的一对引物序列(由上海生工合成)如下：

Nisin5：5′-GCGGCGTGCCTAATACATGC-3′;

Nisin3：5′-TTCCCCACGCGTTACTCACC-3′.

以提取的待测菌株基因组DNA为模板分别进行PCR 扩增，反应体系为：2 μL 模板(基因组)、1 μL Nisin5、1 μL Nisin3、0.5 μL Taq 酶、0.5 μL buffer、1 μL dNTP、39.5 μL ddH2O，反应过程为：95 ℃保持3 min;94℃保持1 min，50℃ +0.2℃保持45 s(此步骤循环30次);72℃保持1 min;72℃保持10 min;降温至12℃，反应结束.反应结束后取40 μL PCR反应液加5 μL 6×DNA上样缓冲液，0.7%琼脂糖凝胶电泳50 min后用凝胶成像仪观察.

(2)DNA目的片段的割胶回收及连接

含有目的DNA片段的条带切胶回收，称重后捣碎.加2倍体积(约800 μL)的 TE缓冲液(1 mol/L pH 8.0的Tris-HCl 1 mL与0.5 mol/L pH 8.0的EDTA 0.2 mL混合，用蒸馏水定容至100 mL)混匀，冰冻5 min后取出熔化，重复熔化3次.加入等体积的Tris饱和酚，混匀后8 000 rpm离心5 min，移上清液至离心管中，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇溶液，重复抽提至液面干净.加1/10体积3 mol/L醋酸钠，2.5倍体积预冷的无水乙醇混匀，4℃过夜后1 3000 rpm离心10min去上清.用预冷70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥沉淀，加10 μL TE缓冲液溶解[12].采用 pGEM-T Easy Vector system 1试剂盒，按照操作说明，将DNA目的片段与pGEM-T Easy Vector连接.

(3)感受态细胞的制备与转化

取-70℃冻存的E.coli JM109，涂布于LB平板上37℃培养过夜.取菌落接种于100 mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12 h.吸取培养液约5 mL于离心管中，4℃，5 000 rpm离心2 min，弃去上清液.加入1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，重悬菌液，4 000 rpm离心4 min，弃去上清液.加入 200 μL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，重悬菌液，即成感受态细胞.加入终浓度为15%(V/V)的灭菌甘油，混匀后即可用于-70℃保存.

取连接产物5 μL加到200 μL感受态细胞中，冰浴30 min，同时设对照，将标准质粒DNA导入感受态细胞中.42℃热激90 s，立即冰浴5 min，加入LB液体培养基800 μL，37℃震荡培养1 h，使细胞复苏.取200 μL菌液涂布于含有Amp的LB平板上(已经涂有X-gal和IPTG)，37℃培养12～16 h，观察平板上的细菌密度并通过显色反应(白斑)初步确定含有重组质粒的阳性克隆，采用3S Spin试剂盒对重组质粒进行提取与鉴定[13].将阳性克隆菌株用LB培养基培养至对数生长期，送交上海生物工程公司测序.

1.3.4 乳链菌肽产生菌抑菌活性研究

藤黄微球菌用S1培养基过夜培养，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌用LB培养基过夜培养.4株乳链菌肽产生菌在GM17培养基中培养过夜，将菌液离心后取其上清液.将S1固体培养基和LB固体培养基灭菌后冷却凝固，按照1%的接种量，将培养好的指示菌液涂布到各自的培养基中，放置约1 h，再倒置于4℃冰箱中1 h.用灭菌的镊子将直径4～6 mm的滤纸片均匀地摆放在培养基表面，在滤纸片上分别滴加10 μL的乳链菌肽产生菌培养液的上清液.在其他的滤纸片上滴加10 μL乳链菌肽(4000 IU/mL)和4 μL卡那霉素作为对照.平板置于30℃培养过夜，观察抑菌圈的大小.抑菌作用强度确定的标准[14]：(1)0～5 mm无抑制作用 (2)6～15 mm弱抑制作用(3)＞15 mm强抑制作用.

2 结果与分析

2.1 乳链菌肽产生菌的定向筛选

无机磷酸根能够刺激发酵过程中Nisin的合成，金属离子也是影响Nisin产生的因素，其中Mg2+能够促进Nisin的活性增加，而Mn2+则可使Nisin的产量减少约1/3[15].编码乳链菌肽前体的基因位于一个可接合转移的转座子上，且与乳链菌肽抗性基因和蔗糖发酵基因紧密连锁[11，16].据此，在蔗糖作唯一碳源，添加适量乳链菌肽以及Na2HPO4和MgSO4·7H2O的GM17选择固体培养基上，配以溴甲酚紫做指示剂，如果一个菌株既对乳链菌肽具有抗性，又能利用蔗糖，则能使菌落周围的培养基由紫色转变为黄色(图1)，由此可初步确定为乳链菌肽产生菌.在筛选平板上这样的菌落很容易用肉眼加以识别.通过抑菌圈法进一步筛选，从中选取抑菌圈较大，抑菌效果较好的菌株.从随机取得的牦牛鲜奶样品中，共获得6株可在选择培养基上生长，并使培养基由紫色转变为黄色的菌.对这6株菌株进行抑菌圈试验，发现其中4株能产生抑菌圈，说明它们是能产生乳链菌肽的菌株，分别命名为Lac1～4.

图1 选择培养基平板上的菌落Fig.1 The colony of selective medium

2.2 乳链菌肽产生菌生理生化指标鉴定

对其生理生化指标测定结果为：Lac1～4均能以蔗糖作为碳源，可发酵葡萄糖产酸产气，V·P试验阳性，接触酶反应显阴性.此外，这4株菌都能在30℃条件下生长繁殖，不耐45℃高温，且能耐4%NaCl.综上所述，符合乳酸乳球菌的生理生化特征[17].

2.3 乳链菌肽产生菌16S rDNA鉴定

以Lac1～4提取的基因组为模板，以Nisin5和Nisin3为引物进行 PCR扩增，获得的扩增结果见图2，泳道1～4分别为Lac1～Lac4的扩增结果.经在NCBI网站上用BLAST程序组进行序列比对，Lac1的16S rDNA的序列对应于乳酸乳球菌(结果中显示的是乳酸乳球菌CAU7946)16S rDNA第92位上碱基的差异为A，与GenBank中收录的乳酸乳球菌16S rDNA相应序列有99%的同源性(如图3所示).Lac2～4的16S rDNA的扩增及测序结果与Lac1完全一致，因此确定这4株乳链菌肽产生菌均为乳酸乳球菌.

图2 乳链菌肽产生菌16S rDNA PCR扩增电泳图Fig.2 16S rDNA PCR electropheretogram of nisin-producing strain

图3 Lac1的16S rDNA序列同源性搜索结果Fig.3 The consequence of sequence homology of 16S rDNA fragment of Lac1

2.4 乳链菌肽产生菌抑菌活性研究

用Lac1、Lac2、Lac3和Lac4这4株乳酸乳球菌的培养上清液分别对不同的指示菌做抑菌圈试验，同时以乳链菌肽和卡那霉素作为对照.结果发现这4株菌的培养上清液对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌均能形成明显的抑菌圈，抑菌圈大小见表1.但这4株菌的培养上清液对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌均没有抑菌活性，推测产生的抑菌物质为乳链菌肽.其中Lac4对藤黄微球菌和金葡菌都体现出强抑制作用，Lac1对藤黄微球菌有强抑制作用，对金葡菌却是弱抑制作用，而Lac2和Lac3对藤黄微球菌和金葡菌都是弱抑制作用.

表1 乳酸乳球菌培养上清液对金葡菌和藤黄微球菌的抑菌圈大小(mm)Table 1 The antibacterial activity of medium supernatant of nisin-producing strain against Staphylococcus aureus and Micrococcus flovus(mm)

3 结论

从随机取得的牦牛鲜奶样品中，使用M17培养基纯化得到6株菌株，对纯化出的6株菌株进行抑菌圈试验，筛选出4株有抑菌作用的菌株，分别命名为Lac1～4，这4株菌均符合乳酸乳球菌生理生化特征.以Lac1～4基因组DNA为模板，用Nisin5和Nisin3为引物进行PCR扩增，测序结果进一步证明待测菌株与乳酸乳球菌16S rDNA序列完全一致，认定筛选得到的Lac1～4均为乳酸乳球菌.

Lac1～4对两种G+菌(藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌)产生了明显的抑菌圈，但对G-菌(鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)却没有抑菌活性.其中Lac4对藤黄微球菌和金葡菌都体现出强抑制作用，Lac1对藤黄微球菌有强抑制作用，对金葡菌却是弱抑制作用，而Lac2和Lac3对藤黄微球菌和金葡菌都是弱抑制作用.