兰陵美酒功能性组分研究

张馨元，管桂坤，万自然，刘明坤，陈 双，徐 岩

（1.山东兰陵美酒股份有限公司，山东临沂277731； 2.江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院酿酒微生物与酶技术研究室，江苏无锡214122)

兰陵美酒是我国历史传统名酒之一，酿制历史可追溯到殷商时代，距今有3000多年的历史。兰陵美酒取优质黍米为原料，以纯净甘洌的古老深井水制糊，放麦曲糖化发酵后，入瓷缸密封，陈酿半年启缸[1]。其酒体呈琥珀光泽，晶莹明澈，保有原料和发酵产生的天然混合香气，浓郁袭人。独特的酿酒原料及酿造工艺不仅赋予怡人的风味，还使兰陵美酒具有较高的保健价值。明代医学泰斗李时珍饮兰陵美酒后，从医学的角度给予高度评价，在他的名著《本草纲目》中记载：“兰陵美酒，清香远达，色复金黄，饮之至醉，不头痛，不口干，不作泻,皆水土之美也，常饮入药俱良”[2]。但目前关于兰陵美酒的功能性组分还缺乏深入科学的解析。

随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，对酒的保健功能的研究越来越受到重视，葡萄酒中最重要的健康成分是功能性酚类化合物，其中主要包括黄酮类化合物和白藜芦醇。有研究报道，饮食中的黄酮类化合物与缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)死亡率呈负相关。红葡萄酒中的类黄酮能够抑制低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的氧化，防止内皮功能障碍，从而抑制动脉粥样硬化的发展。黄酮类化合物不仅为葡萄酒带来了独特的味道和颜色，同时也是葡萄酒中重要的健康成分[3]。而白藜芦醇也是葡萄酒中的一种生物活性物质，因其卓越的保健功效广受关注[4]，其在心血管疾病和癌症等慢性疾病的治疗效果早已有研究报道[5]，大量实验数据也已证明其对高血压、动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞和心力衰竭有积极影响[6]。虽然多酚仅占葡萄酒总量的一小部分，但对心脏病的研究具有潜在的生物学和医学价值[7]。据研究发现，黄酒中也存在一定含量的酚类化合物，对黄酒保健功能具有积极贡献[8]，但目前还缺乏对兰陵美酒中功能性酚类化合物的系统解析。

葡萄酒主要生产国十分重视葡萄酒保健功能的研究，日本也十分重视清酒保健功能的研究。今安聪等从清酒和酒糟中发现9种ACE活性抑制肽（酒中3种，酒糟中6种）,ACE活性抑制肽有助于降低血压；他们还发现了3种抑制脯氨酰内肽酶的肽，这种肽有助于治疗健忘、抑郁、老年性痴呆等疾病[9]。此外爱媛大学医学部的奥田教授从清酒的酒糟提取液和生酒里发现了具有防治糖尿病的胰岛素类活性物质[9]。黄酒与清酒类似，从理论上讲，黄酒尤其是绍兴黄酒的保健功能应优于清酒，但对黄酒的研究还没有引起足够的重视。

然而目前关于黄酒功能性组分的研究还不够深入，戴军等[10]在古越龙山绍兴黄酒中发现了4条活性很强的降血压活性肽和一条降胆固醇的活性肽，说明黄酒中的生物活性肽及氨基酸还有待挖掘。此外糯米黄酒中已检测到种类丰富的麦芽糖、潘糖、异麦芽糖、异麦芽糖三糖等功能性低聚糖[11]，但黍米黄酒中功能性低聚糖还很少有研究报道。因此黄酒中的功能性组分还需进行深入的研究。

本研究以兰陵美酒为研究对象，通过多角度解析兰陵美酒中独特的功能性组分种类及含量特征，试图揭示兰陵美酒保健价值内在的科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：由山东兰陵美酒股份有限公司提供典型兰陵美酒样品，分别编号为1号、2号、3号和4号。

试剂：三氯乙酸、没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸和槲皮素标准品，Sigma公司；乙酸乙酯、冰乙酸，分析纯；甲醇（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水；苯酚（分析纯），西陇化工有限公司；硫酸（优级纯试剂），永华化学科技有限公司；硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠、葡萄糖、盐酸、柠檬酸、小苏打、乳酸、氧化钙均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯），J&K SCIENTIFIC LTD；食用酒精购买于临安卡尔生物科技有限公司；异麦芽糖、异麦芽三糖，SUPELCO公司；潘糖，Fluca公司；乙腈（色谱级），FISHER公司。

仪器：Waters 600高效液相色谱仪、Breeze色谱工作站，苏州市莱顿科学仪器有限公司；R210旋转蒸发仪，BUCHI公司；1100型高效液相色谱仪、G1362A示差折光检测器，Agilent公司；AR224CN电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；ENVI-18固相萃取柱，上海楚定分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氨基酸及总多肽组分的测定

用10 g/100 mL三氯乙酸等体积稀释，记录稀释倍数，放置1 h（难溶品，可超声），保证溶液体系中TCA终浓度为5%。用双层滤纸过滤后取1 mL澄清滤液于1.5 mL离心管内，15000 r/min离心30 min。取400 μL上清液用0.22 μm水膜再次过滤后置于液相样品瓶用于检测分析。

准确吸取0.200 mL混合氨基酸标准溶液，用pH2.2的缓冲液稀释到5 mL，此标准稀释溶液浓度为5.00 nmol/50 μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自耦分析仪，以外标法测定样品的氨基酸含量。

按如下算式计算游离氨基酸含量：

式中：C为游离氨基酸的含量(g/kg)；n为游离氨基酸的检测含量(nmol)；M为游离氨基酸的相对分子质量(g/mol)；d为稀释倍数；V为添加蒸馏水的体积(mL)；m为样品的质量(g)[12]。

1.2.2 功能性多糖的测定

本研究参照谢广发等研究黄酒中功能性低聚糖的方法，取3 mL兰陵美酒样品于10 mL容量瓶中，加入2 mL无水乙醇，加纯净水定容摇匀，用ENVI-18固相萃取柱处理后进样，采用HPLC法（高效液相色谱法）对兰陵美酒中的异麦芽糖进行测定[13]。

1.2.3 功能性酚类化合物的测定

1.2.3.1 样品处理

取100 mL兰陵美酒，用体积分数为37%的H3PO4调节pH值至2，加NaCl 20 g，100 mL乙酸乙酯萃取3次，有机相40℃真空旋转蒸发干，4 mL V(甲醇)∶V(水)=50∶50溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤。低温避光保存备用。

1.2.3.2 色谱条件

Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm i.d.250 mm，5 μm)色谱柱（安捷伦科技有限公司），流动相为A相：甲醇+冰乙酸(0.1%)，B相：水+冰乙酸(0.1%)，进行梯度洗脱，紫外检测波长为280 nm和254 nm（原儿茶酸和香草酸在254 nm处检测，其余在280 nm处检测）；柱温20 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL。

1.2.3.3 外标工作曲线和线性范围的确定

准确称取0.0001 g没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、p-香豆酸和槲皮素溶于V(甲醇)∶V(水)=50∶50溶液中，分别定容于10 mL容量瓶中。稀释成不同浓度梯度，进样量10 μL，绘制标准曲线，计算线性范围、回收率及标准偏差[14]。

1.2.4 抗氧化性的测定

本研究参照李媛媛等[15]在运用微型DPPH、ABTS和FRAP法动态监测从红酒中分离得到的不同种类多酚化合物的抗氧化活性的FRAP法测定兰陵美酒的抗氧化活性，在96孔板中依次加入FRAP工作液和不同浓度的样品溶液和FeSO4、Trolox溶液，摇匀，37℃孵育，测定波长593 nm处的吸光度。在标准曲线上求得相应FeSO4的浓度(mmol/L)，定义为FRAP值。FRAP值越大，抗氧化活性越强。

2 结果与分析

2.1 兰陵美酒中氨基酸及总多肽组分研究

氨基酸是一切蛋白质的组成单位，是人体正常生长、发育和生命活动中不可缺少的营养成分。氨基酸的摄入对于增强体质、提高机体抗病能力有显著作用[16]。本研究分析了兰陵美酒中氨基酸和总多肽的含量（表1），结果表明，在兰陵美酒中检测到17种游离形式存在的氨基酸，包含了人体必需的7种氨基酸，即甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸。兰陵美酒中游离氨基酸的总含量在1.45～2.78 g/L之间，与啤酒中的氨基酸含量1～3 g/L持平[17]，其中兰陵美酒中脯氨酸含量明显高于啤酒中的含量（1.60～3.13 mg/L）[18]。兰陵美酒样品2号中的γ-氨基丁酸的含量为0.13 g/L，γ-氨基丁酸（GABA）是一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动，具有降低血压、改善脑功能、增强记忆、抗焦虑、高效减肥及提高肝、肾机能等生理活性[19]，充分体现了兰陵美酒作为“液体蛋糕”的价值。

除了富含氨基酸外，兰陵美酒中还检测到含量丰富的多肽类化合物，肽是人体重要的生理调节物，它可全面调节人体生理功能，增强和发挥人体生理活性，它具有重要的生物学功能。兰陵美酒中总多肽含量在2.37～7.18 g/L之间，甚至高于总游离氨基酸的含量。以数个氨基酸结合而形成的多肽具有比氨基酸更好的吸收性能和保健价值。很多多肽还具有原蛋白或氨基酸所没有的生理功能，如促进钙的吸收、降血压、降胆固醇、镇静神经、调节免疫、抗氧化、清除自由基、抗癌等生理功能[16]。

表1 兰陵美酒中游离氨基酸的种类及含量 (g/L)

2.2 兰陵美酒功能性多糖研究

功能性低聚糖具有多种重要的生理功能。由于人体内不具备分解、消化功能性低聚糖的酶系统，在摄入后它很少产生热量，但能被肠道中的有益微生物双歧杆菌利用，促进双歧杆菌的增殖，从而改善肠道中的微生态环境，促进对B族维生素的合成及微量矿物质的吸收，提高机体免疫力和抗病力。本研究分析测定了兰陵美酒样品中低聚糖的种类和含量（表2）。兰陵美酒中主要的低聚糖有异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等，总低聚糖含量在7.00～9.52 g/L之间，高于一般黄酒中总低聚糖含量6.50～7.00 g/L的范围[13]。其中潘糖含量为4.35 g/L，一般黄酒中潘糖含量约为3.00 g/L[13]，可见兰陵美酒在这方面明显优于一般黄酒，潘糖作为低聚异麦芽糖中的一种能够维持选择性增殖益生菌，有助于其维持人体肠道功能，増强免疫系统功能，且不增加体内的热量与糖分，具有特殊的生理意义[20]。

表2 兰陵美酒中低聚糖种类及含量 (g/L)

2.3 兰陵美酒功能性酚类化合物的研究

酚类化合物是一类生理活性化合物，多酚类物质具有抗氧化功效，它们通过清除体内过多的自由基，减少过氧化损伤从而有效地延缓心血管疾病、白内障等多种慢性疾病的发生、发展[21]。本研究分析了兰陵美酒典型样品中酚类化合物的含量（表3）。结果表明，在兰陵美酒中共检测到9种功能性酚酸类化合物，主要包含没食子酸、p-羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸等。兰陵美酒中酚酸物质的总含量在101～304 mg/L之间，而干白葡萄酒的酚酸总量一般为120～200 mg/L[22]。兰陵美酒中总酚类物质的含量与干白葡萄酒中总酚类物质的含量处于相同的水平。没食子酸是兰陵美酒中主要的酚酸，其含量超过70 mg/L，远远超过一般葡萄酒中没食子酸的含量0.60～2.20 mg/L[23]，没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化、抗自由基等多种生物学活性[24]，同时也具有一定的抗肿瘤作用[25]。

表3 兰陵美酒中酚酸类化合物种类及含量 (mg/L)

2.4 兰陵美酒抗氧化性功能研究

越来越多的研究显示，抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题，所以抗氧化性食物的摄入对提高机体抗氧化能力具有重要意义。本研究采用FRAP法分析了兰陵美酒样品的抗氧化能力（表4），结果表明，兰陵美酒样品均具有较高的抗氧化能力，其中以1号样品的抗氧化性最高，为4.76 mmol/L，3号、4号和2号样品仅次之，但也均达到3 mmol/L以上，远高于对照黄酒样品的抗氧化性。有文献报道，葡萄酒FRAP抗氧化性能力一般在3～7 mmol/L之间[26]，本研究结果表明，兰陵美酒抗氧化能力接近典型抗氧化饮品葡萄酒的水平。

表4 兰陵美酒抗氧化性能力分析结果 (mmol/L)

3 结论

本研究从基本营养成分和功能性成分角度系统研究了兰陵美酒的营养保健价值。研究结果表明，兰陵美酒中含有丰富的功能性成分。在兰陵美酒中除了较高含量（在1.45～2.78 g/L之间）的17种氨基酸外（包括人体必需的7种氨基酸），生理功能突出的多肽更值得关注。兰陵美酒中检测到的总多肽含量超过2 g/L，远高于啤酒、葡萄酒、日本清酒等酒精饮料。同时在兰陵美酒中还检测到γ-氨基丁酸、酚酸类化合物、功能性低聚糖等多种生理活性成分。γ-氨基丁酸含量在0.01～0.13 g/L之间；低聚糖总含量在7.00～9.52 g/L之间；功能性酚酸类总含量在101.64～304.48 mg/L之间。采用FRAP法测定兰陵美酒的抗氧化活性发现兰陵美酒具有较高的抗氧化活性。由此可见，兰陵美酒是一种富含功能性组分的酒精饮料，适量饮用有益身体健康。