缺血再灌注损伤大鼠学习记忆能力损伤及其与海马突触素表达水平的相关性研究

李建鸿，黄佳，宋长明，杨敏光，金婷婷，柳维林，陶静，陈立典

认知功能障碍是脑卒中后常见的功能障碍之一，大约2/3的脑卒中患者遗留有认知功能障碍问题[1-2]。脑卒中是特定脑区供血障碍的急性神经系统疾病，脑卒中发生后在缺血脑区不同类型神经元均会出现损伤及死亡，但是研究发现海马CA1区的锥状神经元对缺血缺氧尤为敏感[3-4]。而海马在记忆的形成、组织和提取过程中发挥重要作用，海马结构和功能的完整性是正常学习记忆所必须的，因此海马神经元损伤与脑卒中后学习记忆能力下降密切相关[5-6]。因此本课题选取海马作为学习记忆能力障碍的相关研究脑区。突触可塑性是学习记忆的基础，而突触是突触可塑性的关键部位[7]，突触前膜、突触后膜分布着许多信号分子，海马突触素(synaptophysin，SYN)是其家族重要成员之一，其参与突触传递效能的调控，被认为是突触密度与分布的一个重要表现，在突触可塑性中发挥重要作用，与突触重塑和认知过程密切相关[8]。有研究表明大鼠脑梗死后的神经功能缺损症状会伴随突触素表达量明显下降以及神经可塑性破坏[9-10]。故本课题通过观察大鼠缺血再灌注损伤后学习记忆能力的损伤，检测海马突触素SYN的表达水平，并将二者做相关性分析，探讨缺血再灌注损伤大鼠学习记忆能力损伤的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物：将从上海斯莱克实验动物责任有限公司[许可证号：SCXK(沪)2012-003]购买的体质量(250.0±30.0)g的16只SPF级雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠于福建中医药大学实验动物中心[许可证号：SYXK(闽)2013-005]分笼、适应性喂养1周，并对大鼠进行编号、称重进行后续实验。实验过程均严格按照国际动物保护和使用指南的规定操作。②主要试剂和仪器：小鼠来源Anti-Synaptophysin抗体(Abcam，ab8049)、Goat anti-mouse IgG二抗(Proteintech，SA00001-1)、线栓(3600AAA，广州佳灵生物技术有限公司)、7.0 T小动物核磁共振仪(Pharmascan; microMRI, Bruker, Germany)、Barnes迷宫(上海欣软信息科技有限公司)、Bio-Image 分析系统(Bio-Rad Laboratories, Hercu-les, CA, USA)。

1.2 方法 造模与分组：采用随机数字表法将SD大鼠分为模型组(n=10)和对照组(n=6)，参考改良Longa线栓阻塞法[11]，对模型组大鼠行左侧大脑中动脉栓塞法(Middle Celebral Occlusion，MCAO)造模。造模前12h对大鼠禁食并称重，造模前首先用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)，待大鼠进入麻醉状态后沿颈正中切口切开皮肤，暴露出左侧颈总、颈外和颈内动脉并使之分离，随后结扎颈总、颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉。在左侧颈总动脉的结扎处上方用眼科剪剪一“V”型小口，将线栓沿着颈总动脉向颈内动脉方向轻缓推入，推至颈内动脉夹夹闭处时松开动脉夹，继续将线栓推到颅内，感到有轻微阻力便停止推入，造成局灶性脑缺血并开始计时，缝合皮肤，清洁创口，待90min后抽出线栓。对照组大鼠仅对其左侧颈总、颈内、颈外动脉进行分离，但是不插线栓。待大鼠苏醒、恢复活动后，通过Zea-Longa 5分法记录大鼠得分情况并以此检测大鼠神经功能损伤情况判断造模是否成功(Zea-Longa评分在1～3分视为造模成功)。造模结束后，模型组有3只大鼠出现死亡，1只大鼠造模不成功(Zea-Longa评分为0分)，最后模型组造模成功6只全部纳入实验，对照组大鼠6只全部存活纳入实验。

1.3 观察指标 ①Zea-longa神经行为学评分：造模后2h，大鼠完全清醒恢复活动，对其行Zea-Longa神经功能缺损评分，根据 Zea-Longa 5分制评分标准，评分在1～3分之间的大鼠被认为造模成功。具体评分分级如下：0分，无神经缺损症状；1分，右前肢内收，悬尾测试后不自觉向右侧旋转；2分，放在地面后会不自觉的向右侧转圈；3分，无法走直线，肢体向右侧倾斜；4分，完全无意识，无法行动。② T2W1观察脑梗死体积：在造模24h后分别对2组大鼠行核磁共振扫描。用5%异氟烷诱导麻醉5min后，2%的异氟烷维持麻醉对3组大鼠进行T2WI扫描，用动物生理检测仪密切观察扫描大鼠的呼吸、心率。观察大鼠左侧大脑梗死体积。T2WI扫描参数：TR 2738 ms，TE 33 ms，TR/TE=4111.669/55ms，FOV=32×32mm，Averages=2，Matrix=256×256，Slices=21，Slice Thickness=0.8mm， Time=5min50s。扫描完成后采用Image J软件计算脑梗死体积。③Barnes迷宫检测学习记忆能力：Barnes迷宫的主体是一个黑色圆形平台，该平台直径为122cm，在平台周围分布有20个等距、等大的圆形镂空小洞，每个镂空小洞的洞口直径都是10cm，其中一个洞口下方放置一个黑色不透光的盒子(目标盒)作为大鼠的安全躲避场所；而其它洞的底部不放置盒子。每次检测前先将大鼠于目标盒内放置30s，检测过程中采用噪声或风吹等干扰刺激促使大鼠进入目标盒、安全躲避。造模后第3天开始迷宫测试，首先把大鼠放置在圆形平台中央的起始盒内，拿走起始盒后开始300s倒计时，在这个过程中记录其进入目标盒所用的时间(逃避潜伏期)和探索错误洞口的次数(口、鼻、四肢对洞口的触碰均记为探索)，连续5d。若大鼠在300s内未找到目标洞口进入目标盒，记逃避潜伏期为300s。每次测试结束后都旋转上层圆形平台并用70%的酒精纱布进行擦拭清洗平台、目标盒以防止大鼠凭借气味寻找到目标盒，但要保持目标盒的相对空间位置不变。各组进入错误洞口次数、逃避潜伏期的计算方式皆取5d的平均值。④免疫印迹蛋白检测SYN表达水平：Barnes迷宫测试结束后将大鼠麻醉、断颈后快速分离左侧大脑海马置于-80℃冰箱保存。每100mg脑组织加1ml细胞裂解液和10ul 的PMSF储存液，充分研磨后离心，取上清液，用BAC法测定蛋白浓度。待样品蛋白变性后，取50ug样品蛋白，经10%SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜上。在室温条件下封闭2h，用SYN(1：1000)和β-action(1:8000)一抗孵育，于4℃冰箱过夜，第2天加入相应的二抗(1:2000)于室温下放置1h。最后将PVDF膜放置在图像扫描仪上，避光配置显色液并将其覆盖于PVDF膜上，反应1min，用Image-lab图像分析系统分析处理。用目标条带灰度值占β-action条带灰度值的百分比来反应目标蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 Zea-longa神经行为学评分 造模2h后，对符合模型组纳入标准的6只大鼠重新编号，其Zea-longa神经行为学评分分别为2、2、3、2、1及3分。对照组大鼠6只Zea-longa评分结果均为0分。

2.2 脑梗死体积 T2W1扫描结果显示：造模24h后，模型组大鼠6只出现脑梗死，箭头所示，对照组大鼠6只无脑梗死。见图1。

图1 2组大鼠造模后24h的T2加权成像

2.3 Barnes迷宫测试结果 Barnes结果显示：对照组寻找目标盒路径清晰直接；模型组路径杂乱无章、毫无目标性，见图2。与对照组相比，模型组大鼠寻找到目标盒的平均潜伏期显著延长(P<0.01)；模型组进入错误洞口的平均次数显著增加(P<0.01)，见表1。

对照组 模型组

组别n潜伏期(s)进入错误洞口次数(次)对照组699.38±11.668.59±1.38模型组6212.43±20.08a23.44±1.25a

与对照组比较，aP<0.01

2.4 SYN表达水平 免疫印迹蛋白结果显示：与对照组相比，模型组大鼠SYN表达水平显著下降(0.56±0.23、1.27±0.33，P<0.01)。

2.5 SYN表达水平与大鼠学习记忆能力相关性 SYN表达水平与大鼠逃避潜伏期显著负相关(r=-0.916，P<0.05)，见图3；SYN表达水平与大鼠进入错误洞口次数显著负相关(r=-0.87，P<0.05)，见图4。

图3 SYN表达量与大鼠逃避潜伏期相关性

图4 SYN表达水平与进入错误洞口次数相关性

3 讨论

海马在学习记忆等认知功能过程中起关键性作用[12]，一项关于双侧海马损伤的人类行为研究显示海马损伤与空间记忆缺陷有关，表现为生活中不能进行正确的空间导航而迷路[13]。有关海马损伤在啮齿类动物中的研究更为广泛，包括空间工作记忆损伤[14]，对于相似环境的辨别能力障碍等[15]。本课题通过Zea-longa神经行为学评分及核磁共振成像扫描，证明了缺血再灌注模型制备成功，并且模型组大鼠出现不同程度的海马损伤。随后本课题通过Barnes迷宫对大鼠学习记忆能力进行检测，实验结果表明模型组大鼠学习记忆能力下降明显，表现为在迷宫测试过程中逃避潜伏期延长以及进入错误洞口次数的增多。

学习记忆能力下降会伴随海马活动紊乱其很可能与神经递质释放、神经调节受损密切相关[16-17]。而突触小泡介导的递质释放是神经元信息传递的主要机制，在神经传递的过程中突触素被认为可以调节突触小泡的循环效率，被认为与突触可塑性密切相关。Schmitt等[8]对突触素基因敲除的小鼠进行试验，结果发现与野生组小鼠相比，突触素基因敲除的小鼠出现明显的学习记忆能力下降，在加强旷场实验中表现为对新颖物体的辨识度下降，在水迷宫训练的空间探索实验过程中逃避潜伏期明显延长，在定位航行过程中进入目标象限时间明显减少，而视网膜电图参数显示基因敲除小鼠与野生鼠无差异，表明学习记忆能力下降并非是由于视力损伤导致的。海马接受从内嗅皮层而来的神经投射，该环路与学习记忆能力相关，Smith等[18]发现老年大鼠海马突触素表达减少，这可能是老年大鼠学习记忆能力下降的重要原因之一。同样的，有研究分别对3月龄、12月龄和26月龄大鼠海马突触素蛋白进行检测，结果发现随着月龄增加，大鼠海马区突触素表达显著下降[19]。在人类研究水平上突触素也被证明与认知功能密切相关，Li等[20]的研究表明了在围生期及婴幼儿期铅暴露过多导致的认知功能障碍很可能是由海马突触素表达水平下降引起的。不仅如此，脑组织突触素蛋白表达量下降已见于多种神经系统退行性疾病，临床尸检已证实阿尔茨海默病患者前额叶和海马等脑区突触素表达下降，并且其表达水平与临床症状呈负相关[21]。突触素蛋白在脑缺血再灌注损伤大鼠模型已有相关研究，Hou等[22]的研究显示脑缺血再灌注损伤后的神经缺损与突触素蛋白减少有关。早期研究表明电针、药物等治疗方法均可通过提升大脑突触素表达水平改善缺血再灌注大鼠学习记忆能力、促进运动功能的恢复[23-24]。但是未有研究对缺血再灌注损伤后学习记忆能力损伤与突触素蛋白之间相关性进行研究。

本课题通过蛋白免疫印迹技术检测大鼠海马突触素表达水平，结果发现与对照组相比，模型组大鼠海马突触素表达量显著下降。并且相关性分析表明模型组大鼠海马突触素表达水平与大鼠逃避潜伏期、进入错误洞口次数呈显著负相关。这些研究结果揭示了：缺血再灌注损伤导致的学习记忆能力下降可能与海马突触素SYN表达水平下降，导致突触可塑性受损有关，并且随着SYN表达的下降，大鼠学习记忆能力受损越严重。这一结果可为后续研究奠定理论基础。