石斛枸杞颗粒对小鼠免疫功能的影响

邱涵，吕晓君

石斛、枸杞是我国传统的珍贵中药材，早在《神农本草经》中就有记载，石斛有滋阴清热、生津养胃、润肺止咳，明目强身等功效[1]，枸杞有滋阴补血、补肾养肝、润肺止咳、益精明目等功效[2]。现代药理学研究表明，石斛属和枸杞属植物均具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、治疗眼病等作用[3-9]。有研究报道，石斛复方制剂可通过增强巨噬细胞的吞噬能力、促进T淋巴细胞的增殖和分化和提高NK细胞活性的机制来调节小鼠的免疫功能[10]；枸杞的活性物质枸杞多糖可在体内外调节对小鼠巨噬细胞的免疫功能[11]，并对机体T细胞免疫功能、体液免疫功能、NK细胞非特异性免疫功能均具有显著的调节作用[12]。石斛枸杞颗粒是由铁皮石斛、枸杞子等药材合理组方而成的复方制剂，本实验自2017年1月研究考察石斛枸杞颗粒对免疫器官、细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能和NK细胞功能的影响，研究其对小鼠免疫功能的影响，为石斛枸杞颗粒进一步开发利用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1受试物石斛枸杞颗粒由湖北金鹰生物科技有限公司生产(规格：5 克/袋，批号20160303)，性状为棕色颗粒。人体推荐量为每日3次，每次1袋，计0.25 g/kg/d(人按60 kg计算)。保存条件：储放于通风阴凉干燥处，保质期：24个月。

1.2实验动物雌性SPF级昆明小鼠，160只，体质量18～22 g，购自武汉生物制品研究所有限责任公司，质量合格证号42000400004987，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2012-0013。本研究中对于小鼠的处理符合动物伦理学标准。

1.3仪器与试剂AB204-S电子天平和XS6001S电子秤，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；YLS-25A电动耳肿打耳器，济南益延科技发展有限公司； 3K15台式冷冻离心机，德国Sigma公司；HF90二氧化碳培养箱，力新仪器上海有限公司；BX53显微镜，日本OLYMPUS公司；AU400全自动生化仪，日本OLYMPUS公司。RPMI 1640培养基，Gibco公司，批号1645374；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号20150616；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产，批号142714011。小鼠淋巴瘤细胞(YAC-1细胞)，购自中国典型培养物保藏中心。

1.4方法[13]

1.4.1实验分组及受试物给予方式 小鼠按体质量采用随机数字表法分成4个实验组，每个实验组的40只动物分为4组(高、中、低3个剂量组及阴性对照组)。设石斛枸杞颗粒高剂量组(7.5 g/kg BW，相当于人体推荐量的30倍)、中剂量组(5.0 g/kg BW，相当于人体推荐量的20倍)、低剂量组(2.5 g/kg BW，相当于人体推荐量的10倍)。临用前将受试物用蒸馏水配制成0.375，0.250，0.125 g/mL三种浓度的混悬液。各组小鼠灌胃给予不同浓度的受试物，灌胃体积为20 mL/kg BW。阴性对照组给予等体积蒸馏水。每天灌胃1次，连续30 d。灌胃结束后处死动物，4个实验组分别按1.4.2～1.4.7进行实验：第1实验组，迟发型变态反应(DTH)实验；第2实验组，抗体生成细胞检测和血清溶血素测定；第3实验组，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；第4实验组，NK细胞活性测定、免疫器官脏/体比。

1.4.2体质量及免疫器官脏/体比测定 所有动物每周称量体质量一次，灌胃30 d后处死小鼠。第4实验组小鼠的取出胸腺和脾脏，称重并计算脏/体比值。脏/体(%)=脏器重量/动物体质量×100%。

1.4.3迟发型变态反应实验 采用二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠DTH实验(耳肿胀法)。小鼠腹部脱毛，用1% DNFB溶液涂抹50 μL致敏，5 d后，再用1% DNFB溶液10 μL均匀涂抹小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24 h处死动物剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8 mm的耳片后分别称重，以左右耳的重量之差来反映DTH的程度。

1.4.4抗体生成细胞检测实验 采用Jerne改良玻片法。将脱纤维处理后的羊血用生理盐水洗涤3次，离心1 500×g/min 10 min，用生理盐水配成2%(V/V)的绵羊红细胞(SRBC)悬液，每只鼠经腹腔注射2%(V/V) SRBC 0.2 mL进行免疫。5天后处死小鼠，取出脾脏，制备脾细胞悬液，调整脾细胞浓度为5×106个/mL。将0.5 mL 0.5%琼脂糖、50 μL 10% SRBC、20 μL 脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，37 ℃温育1.5h，然后加入补体，继续温育1.5 h，计数溶血空斑数。以空斑数/106脾细胞表示抗体生成细胞数。

1.4.5血清溶血素测定实验 采用血凝法，与1.4.4实验共用小鼠。免疫5 d后，小鼠摘眼球取血，制备血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%(V/V)的SRBC悬液，混匀，37 ℃温育3 h，观察血球凝集程度，进行血清溶血素的测定，计算抗体水平。

1.4.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 采用滴片法。每只小鼠腹腔注射2%(V/V) SRBC 0.2 mL。4 d后颈椎脱臼处死小鼠，每只腹腔注射加小牛血清的Hank's液4 mL，充分洗出腹腔巨噬细胞，收集腹腔洗液至试管内。在试管内加入0.5 mL腹腔洗液、0.5 mL 1%鸡血红细胞悬液，混匀，吸取0.5 mL混合液加入玻片上已晾干的3%琼脂圈内，37 ℃温育20 min，甲醇固定、Gimsa液染色，显微镜观察，计数吞噬率和吞噬指数。

1.4.7NK细胞活性测定，采用LDH 测定法 末次给予受试样品后，处死小鼠，无菌操作下取脾，研磨制成单个脾细胞悬液后，过200目筛网后Hank′s液洗2次，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度至2×107个/mL。以脾细胞悬液为效应细胞，取对数生长期的YAC-1细胞，调整细胞终浓度至4×105个/mL作为靶细胞，作用4 h后，离心取上清，全自动生化分析仪检测细胞上清液中LDH含量，计算NK 细胞活性。

2 结果

2.1对小鼠体质量的影响结果见表1，石斛枸杞颗粒各剂量组小鼠整个试验过程中体质量与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2对小鼠淋巴器官脏器/体质量比值的影响结果见表2，石斛枸杞颗粒各剂量组小鼠胸腺/体质量比值和脾脏/体质量比值较阴性对照组差异无统计学意义。

表1 石斛枸杞颗粒对小鼠体质量的影响

表2 石斛枸杞颗粒对小鼠淋巴器官脏器/体质量的影响

2.3对细胞免疫功能的影响结果见表3，石斛枸杞颗粒中、低剂量组能增加耳廓肿胀度，与阴性对照组比较差异有统计学意义，说明其可促进小鼠对DNFB诱发的DTH反应，具有增强细胞免疫功能的作用。

表3 石斛枸杞颗粒对DNFB诱导小鼠DTH反应的影响

注：各剂量组与阴性对照组比较，aP<0.05

2.4对体液免疫功能的影响结果见表4，石斛枸杞颗粒各剂量组的溶血空斑数、血清溶血素水平与阴性对照组相比，差异无统计学意义，说明其不能增强体内抗体生成细胞能力和增加抗体生成水平，即石斛枸杞颗粒对体液免疫功能无明显影响。

2.5对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表5，石斛枸杞颗粒高剂量组可提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数，与阴性对照组比较差异有统计学意义，说明其可增强小鼠单核-巨噬细胞的吞噬能力。

2.6对小鼠NK细胞活性的影响结果见表6，石斛枸杞颗粒高、中剂量组能增强小鼠NK细胞活性，与阴性对照组比较差异有统计学意义。

3 讨论

免疫系统是机体执行免疫应答和免疫功能的重要系统，是生物体识别“非自体物质”并将其消灭或排除体外，抵御病原体入侵的保卫系统。免疫细胞、免疫分子和免疫器官共同构成机体的免疫系统，并与其他系统相互协调，共同维持机体生理功能的平衡。机体正常免疫功能状态的维持需要多种免疫细胞的相互作用和制约，免疫功能是在淋巴细胞、单核细胞和其他有关细胞及其产生的免疫分子的相互作用下完成的，主要包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核细胞吞噬功能和NK细胞功能，它们相互配合完成特异性免疫和非特异性免疫。细胞免疫和体液免疫属于特异性免疫，腹腔巨噬细胞吞噬能力和NK细胞功能属于非特异性免疫[14-16]。本实验研究观察了石斛枸杞颗粒对体质量和免疫器官的作用，同时从细胞免疫、体液免疫、吞噬功能、NK细胞功能四个方面检测和其对小鼠免疫功能的影响。结果显示，石斛枸杞颗粒对小鼠体质量和脾脏脏/体比、胸腺脏/体比无显著性影响，说明其对免疫器官的作用不明显。迟发型变态反应是T细胞介导的一种超敏反应，二硝基氟苯(DNFB)是一种半抗原，将其涂抹小鼠腹部皮肤后，与皮肤蛋白结合形成完全抗原，刺激小鼠T淋巴细胞会增殖成致敏淋巴细胞，当再次涂抹至小鼠耳部时刺激记忆细胞迅速增殖，产生变态反应引起耳廓肿胀，发生以单核细胞浸润为主的炎症反应，属于细胞免疫应答功能；石斛枸杞颗粒可引起耳廓肿胀度增加，促进小鼠DTH反应，提示其可增强细胞免疫功能。用SRBC免疫小鼠数天，能够刺激小鼠B细胞产生抗体，用免疫后的小鼠血清对SRBC的溶解能力反映了小鼠抗体分泌细胞分泌抗体的能力，属于体液免疫应答功能；本研究中石斛枸杞颗粒对血清溶血素水平和抗体生成能力无明显影响，说明其对体液免疫功能无明显作用。巨噬细胞是一种非特异性免疫细胞，可通过直接吞噬外来异物或自身衰老的细胞来发挥提高机体免疫力的作用，因此，巨噬细胞吞噬活性的大小在一定程度上反应了机体的非特异性免疫功能，利用巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，可以在体外观察巨噬细胞的吞噬功能；石斛枸杞颗粒可增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数，说明其可激活单核-巨噬细胞免疫系统，增强非特异性免疫功能。NK细胞具有自然杀伤活性及抗肿瘤作用，活细胞胞浆内的LDH不能透过细胞膜，当YAC-1细胞(小鼠淋巴瘤细胞)受到NK细胞杀伤后，LDH释放到细胞外，因此通过检测细胞上清液的LDH含量来反映NK细胞的活性；石斛枸杞颗粒可增加细胞上清液的LDH含量，说明其可增强NK细胞功能。

表4 石斛枸杞颗粒对小鼠抗体生成细胞和血清溶血素的影响

表5 石斛枸杞颗粒对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

表6 石斛枸杞颗粒对小鼠NK细胞活性的影响

注：与阴性对照组比较，aP<0.05，bP<0.01

综上所述，本研究结果表明石斛枸杞颗粒对小鼠细胞免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性均有增强作用，促进了小鼠的特异性免疫和非特异性免疫，具有增强免疫功能的作用，是一种具有良好开发前景的免疫调节剂。