基于HPLC波长切换法对养胃宁胶囊中6种成分的质量控制研究

孙辉，何胜利

养胃宁胶囊系香附(醋)、水红花子(炒)、草豆蔻、香椽、当归等12味中药材加工而成，收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第十三册，具有调中养胃、理气止痛的功效，其适应证主要为急慢性胃炎、溃疡病，胃神经官能症等疾病，临床疗效显著[1]。养胃宁胶囊现行标准未对方中药物成分进行定量测定研究，王英伟等[2]仅对该制剂中所含大黄酚进行了含量测定，未检索到对养胃宁胶囊中多成分定量测定的文献报道。方中香附[3-4]为莎草科植物莎草的干燥根茎，具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的作用，主要用于脾胃气滞、脘腹痞闷、胀满疼痛、肝郁气滞、胸胁胀痛等症状的治疗；水红花子[3]为蓼科植物红蓼的干燥成熟果实，具有消积止痛、利水消肿、散血消癥的功效，主要用于食积不消、胃脘胀痛、水肿腹水等症状的治疗；草豆蔻[3,5]温中止呕、燥湿行气，香椽[3]舒肝理气、宽中化痰。笔者2016年1月至2017年1月采用HPLC波长切换法，对养胃宁胶囊主要药味香附所含主要成分α-香附酮，水红花子所含指标性成分花旗松素，草豆蔻的指标性成分山姜素、乔松素、小豆蔻明和桤木酮进行了同时测定研究，所建立的方法操作简便、准确，重复性好，为养胃宁胶囊质量标准的提高提供了数据支持。

1 仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；BP211DAG型电子天平，德国Sartorius公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

2 试药与试剂

养胃宁胶囊(规格：每粒装0.3 g，批号：160501、170101、170601)来源于通化茂祥制药有限公司；对照品花旗松素(批号：111816-201102，含量：98.9%)、山姜素(批号：110762-201405，含量：97.5%)、乔松素(批号：111829-201703，含量：99.5%)、小豆蔻明(批号：110763-201604，含量：99.8%)、桤木酮(111830-201703，含量：99.8%)、α-香附酮(批号：110748-201714，含量：99.4%)均来源于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。

3 方法与结果

3.1溶液的制备

3.1.1对照品溶液 分别精密称取花旗松素对照品、山姜素对照品、乔松素对照品、小豆蔻明对照品、桤木酮对照品、α-香附酮对照品各适量，用甲醇溶解并制成质量浓度为0.436、1.578、1.314、0.978、1.152、0.358 mg/mL的单一组分对照品储备液。再精密吸取各对照品储备液2.5 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得养胃宁胶囊检测用混合对照品溶液。

3.1.2供试品溶液 取养胃宁胶囊适量，倾出内容物，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，称重，超声(功率：500 W，频率：40 kHz)提取30 min，放冷，擦干外壁，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，续滤液作为养胃宁胶囊供试品溶液。

3.1.3阴性样品溶液 按照养胃宁胶囊的处方和制备工艺，分别制备缺水红花子(炒)阴性样品、缺草豆蔻阴性样品和缺香附(醋)阴性样品，再按照“3.1.2”项下养胃宁胶囊供试品溶液制备方法制成水红花子阴性样品溶液、草豆蔻阴性样品溶液和香附阴性样品溶液。

3.2色谱条件采用Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脱(0～10 min，36.0%A；10～14 min，36.0%A→48.0%A；14～30 min，48.0%A→62.0%A；30～37 min，62.0%A→70.0%A；37～45 min，70.0%A→36.0%A)；0～30 min在300 nm[3,6-7]波长下检测花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明和桤木酮，30～45 min在242 nm[8-11]波长下检测α-香附酮；流速：0.9 mL/min；柱温：25 ℃；进样量为10 μL。

3.3方法学考察

3.3.1专属性考察 精密量取“3.1”项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各适量，依法进样测定，结果见图1，阴性样品溶液均无干扰，理论塔板数按所测各成分计均不低于3 000，所测各成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮色谱峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5。

注：a.混合对照品溶液；b.养胃宁胶囊；c.水红花子阴性样品溶液；d.草豆蔻阴性样品溶液；e.香附阴性样品溶液;1.花旗松素；2.山姜素；3.乔松素；4.小豆蔻明；5.桤木酮；6.α-香附酮

图1养胃宁胶囊HPLC色谱图

3.3.2线性关系考察 分别精密吸取“3.1.1”项下制备的花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮对照品储备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇制成25倍浓度差的6个混合对照品溶液，依法进样测定，采用花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮质量浓度c为横坐标，所测各成分峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线进行回归计算，回归方程分别为花旗松素：A=8.5594×105c+427.1；山姜素：A=1.6057×106c+256.9；乔松素：A=1.7365×106c-372.8；小豆蔻明：A=1.3219×106c+281.7；桤木酮：A=1.5698×106c-277.1；α-香附酮：A=9.0572×105c+169.4。花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮分别在2.18～54.50 μg/mL(r=0.999 9)、7.89～197.25 μg/mL(r=0.999 6)、6.57～164.25 μg/mL(r=0.999 8)、4.89～122.25 μg/mL(r=0.999 7)、5.76～144.00 μg/mL(r=0.999 9)、1.79～44.75 μg/mL(r=0.999 1)范围内线性关系良好。

3.3.3精密度试验 取“3.1.1”项下制备的养胃宁胶囊检测用混合对照品溶液，依法进样测定花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮峰面积，结果所测6个成分峰面积的RSD分别为1.11%、0.95%、1.02%、0.98%、0.83%和1.26%。

3.3.4稳定性试验 取养胃宁胶囊(批号：160501)的同一供试品溶液，分别在室温下第0、2、4、8、12和16 h进样，结果养胃宁胶囊供试品溶液室温下16 h稳定，所测各成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮峰面积的RSD分别为1.05%、0.88%、0.95%、1.11%、0.67%和1.20%。

3.3.5重复性试验 取养胃宁胶囊(批号：160501)，按照“3.1.2”项下制备方法制备养胃宁胶囊供试品溶液6份，依法进样测定，记录花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮峰面积，计算所测各成分含量，结果所测各成分含量的RSD分别为1.46%、0.59%、0.82%、1.39%、1.27%和0.96%。

3.3.6加样回收率试验 取已知含量的养胃宁胶囊(批号：160501)，倾出内容物，取6份，每份约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入花旗松素对照品溶液(0.514 mg/mL)0.5 mL、山姜素对照品溶液(0.905 mg/mL)1.0 mL、乔松素对照品溶液(0.762 mg/mL)1.0 mL、小豆蔻明对照品溶液(0.561 mg/mL)1.0 mL、桤木酮对照品溶液(0.659 mg/mL)1.0 mL和α-香附酮对照品溶液(0.417 mg/mL)0.5 mL，再按照“3.1.2”项下养胃宁胶囊供试品溶液制备方法制备加样回收样品溶液，依法进样测定，计算所测各成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮加样回收率，结果见表1。

表1 花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮、α-香附酮的回收率

3.4养胃宁胶囊的含量测定取批号为160501、170101、170601的养胃宁胶囊，按照“3.1.2”项下养胃宁胶囊供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法进样测定，记录花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮峰面积，采用外标法计算所测各成分含量，结果见表2。

表2 含量测定结果/(mg/g)

4 讨论

4.1养胃宁胶囊供试品溶液制备方法的优化本实验考察了不同提取溶剂(甲醇[3,7-9]、70%甲醇、乙醇[12]、70%乙醇[13])对养胃宁胶囊中所测成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮提取率的影响，对比结果显示甲醇的提取效果优于其他提取溶剂；在此结果基础上，对养胃宁胶囊供试品的提取方式(超声提取[2,7-8]和加热回流提取[3])和提取时间(15 min、30 min和45 min)进行了对比考察，最终优选养胃宁胶囊供试品溶液最佳的制备方法为甲醇溶液超声提取30 min，此条件下所测成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮的综合提取率最佳。

4.2色谱条件中流动相的优化本实验对比考察了甲醇-水[3,7-9,13-14]、乙腈-水[15]等度洗脱，以所测成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮的峰形、分离度以及色谱峰基线平稳等为评价指标，结果甲醇-水流动相优于乙腈-水流动相体系，但所测成分α-香附酮峰形较差，乔松素色谱峰分离效果欠佳；在此结果基础上，笔者又分别考察了甲醇-0.1%磷酸溶液[16-17]、甲醇-0.1%冰醋酸溶液为流动相，同时采用梯度洗脱方法，对流动相的比例进行不断摸索，最终确定采用甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，按照文中“3.2”项下的规定的程序梯度洗脱，此条件下所测色谱峰基线平稳，所测成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮色谱峰峰形对称，分离度符合要求。

本研究采用HPLC波长切换联合梯度洗脱法，同时对养胃宁胶囊中6个成分花旗松素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮和α-香附酮的含量进行了测定，所建立的方法简便、快捷，重复性好，灵敏度高，为养胃宁胶囊质量标准的提高提供了数据支持。