不同化学处理方法对PEEK材料表面改性及生物学行为的影响

李艳华 何东 王菁 吴高义

目前临床应用的植入材料多为金属材料如钛合金等，研究发现这类材料弹性模量较高，而且与人体骨骼应力匹配不足[1]，不耐人体酸碱腐蚀从而释放金属离子，造成植入物边缘骨质流失，种植体松动、脱落，还可为细菌入侵提供通道[2]。该类金属材料在CT成像时出现“星状放射”现象，还与MRI不可兼容。生物陶瓷是另外一种重要植入材料，其中以羟基磷灰石最为常用，但其脆性高、强度低、耐疲劳性能差，临床应用受限[3]。

近期研究发现一种新型线性芳香族、半结晶高分子聚合物-聚醚醚酮(Polyetheretherketone, PEEK)，该材料的弹性模量高度接近皮质骨，具有优越的力学性能、耐磨性以及良好的耐腐蚀性[4]。PEEK及其复合材料作为一种新型的生物材料已逐渐应用于椎间融合、人工关节置换及创伤植入等领域[5]，展现出较好的应用前景。然而PEEK材料的表面疏水性及化学惰性往往限制了PEEK材料的生物性能[6-8]。

为了提高PEEK的生物性能，众多学者通过物理、化学方法对PEEK及其复合材料进行表面或复合改性。如PEEK与羟基磷灰石(HA)通过共混或冷喷涂技术获得PEEK-HA复合材料，体内、外实验发现，PEEK-HA具有优良的生物性能，但是该复合材料的界面结合力依然较差[9-10]。材料表面改性是提高材料表面力学性能和生物学性能的有效途径，同时也保持了材料本身的优越性[8]。然而，聚合材料的导热系数较低，很难形成均质的表面，而化学改性操作简单、重复性高，可形成均质的表面，是很好的选择。既往研究通过磺化反应，在PEEK材料表面形成三维网状结构，进一步研究证实，多孔的PEEK材料无论是在体外细胞实验，骨髓间充质干细胞的前期粘附、增殖、分化或体内动物实验中种植体周围新骨的生成均表明磺化后的PEEK具有优良的生物性能[9-10]。研究发现具有相同形貌磺化PEEK，会因材料表面残余硫(S)而影响材料的生物相容性。本研究探讨化学方法改性PEEK材料以提高其生物性能。

1 材料与方法

1.1 制备PEEK试件

将医用级的PEEK材料(Thornton Cleveleys, United Kingdom)制成10 mm×10 mm×1.0 mm 以及15 mm×15 mm×1.0 mm方形试件, 依次用 600#、800#、1000#、 1200#、 1500#、2000#、3000#、5000#、7000#SiC砂纸逐级打磨、抛光。进一步用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗 10 min，干燥后备用。

1.2 试件分组

A.空白对照组(PEEK)：按 2.1 所述，依次打磨抛光，按顺序超声清洗后干燥备用; B.硫酸磺化5 min组(S1-PEEK)：为了得到大小均质的网状结构，磁力搅拌贯穿浸泡全过程。按2.1清洗后的PEEK薄片放入磁力搅拌的浓硫酸(浓度约为95%～98%)中，室温下作用5 min，将薄片取出，置于去离子水中浸泡约5 min，然后置入100 ℃去离子水中加热4 h; C.硫酸磺化10 min组(S2-PEEK): PEEK薄片放入磁力搅拌的浓硫酸(浓度约为95%～98%)中浸泡作用10 min，其余操作与B组相同; D.硫酸磺化5 min+硝酸组(S+n-PEEK)：磁力搅拌贯穿全过程，按2.1清洗后的PEEK薄片放入磁力搅拌的浓硫酸(浓度约为95%～98%)中作用5 min，将薄片取出放入硝酸(浓度约为65%～68%)中，室温下50 s，然后将薄片浸没在去离子水中5 min，最后置入100 ℃去离子水中加热4 h; E.高锰酸钾+磷酸蚀刻组(Mn-PEEK)：磁力搅拌贯穿全过程，按2.1清洗后的PEEK薄片放入磁力搅拌的混合溶液中(1 g高锰酸钾+20 ml 65%～68%的磷酸)室温下作用20 min，将薄片取出，浸没于去离子水中5 min，最后置于100 ℃去离子水中加热4 h。

1.3 检测PEEK试件表面特性

使用JSM-4800 型 FE-SEM 观察各组PEEK试件的表面形貌。应用X射线光电子能谱(XPS)检测制备试件的化学组成。

1.4 统计学分析

1.5 体外实验

1.5.1 骨髓间充质干细胞的培养 100 g左右SD大鼠(购于第四军医大学动物实验中心)脱臼处死后，75%乙醇浸泡15 min，在无菌操作台上分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50 mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织。剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10 ml注射器抽取适量PBS+血清混合液冲洗骨髓腔至其发白为止。将细胞悬液以1 200 r/min离心5 min，去除上清液后加入细胞培养液，吹打混匀。置入细胞培养箱中常规培养。

1.5.2 细胞形态学检测 将对数生长期的骨髓间充质干细胞以2×104cells/cm2密度依次接种到PEEK、 S1-PEEK；S2-PEEK；S+n-PEEK；Mn-PEEK试件上(每组3 个平行样本，即n=3)。培养4 h后用PBS清洗3 次， 在4 ℃的条件下用4%的多聚甲醛固定30 min，再用PBS清洗3 次； 30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 100%梯度酒精脱水、干燥、喷金。

2 结 果

2.1 PEEK材料表面形态、元素组成及含量

FE-SEM 观察各组试件表面形貌，可见不同的微观结构(图 1)。空白对照组，低倍镜(×500)下可见材料表面存在均匀一致且平行的打磨抛光痕迹，而高倍镜(×10 000)下可见明显的打磨痕迹。硫酸磺化5 min组(S-PEEK)，低倍镜(×500)下观察可见材料表面为均匀的多孔状结构，高倍镜(×10 000)下可见明显的微米级3D筛孔状结构。硫酸磺化10 min组(S2-PEEK)，低倍镜(×500)下观察可见材料表面为均匀的多孔状结构与硫酸磺化5 min组未见明显不同，但高倍镜(×10 000)下观察可见微米级3D筛孔状结构较硫酸磺化5 min组明显增大，而形态则十分相似。硫酸磺化+硝酸组(S+n-PEEK)与硫酸磺化5 min组极为相似。高锰酸钾+磷酸组(Mn-PEEK)，低倍镜(×500)下观察可见材料表面较光滑，而高倍镜(×10 000)下观察可见与众不同的花瓣样结构。

表 1所示为各试件表面元素组成及元素含量。由表可见PEEK试件表面经处理后主要含有C、O、S等元素。浓硫酸磺化处理的PEEK都含有S元素，然而水浴加热处理后S元素的含量各不相同。既往研究证明通过磺化反应，磺酸基团(-SO3H)会进入PEEK的碳氢骨架中[11]。各组中硫(S)元素的质量百分比：S1-PEEK(2.45±0.22)较S2-PEEK(3.48±0.16)的S含量偏低(P=0.000)，然而S含量却高于S+n-PEEK(1.79±0.05,P=0.002)。S2-PEEK(3.48±0.16)的磺化结果提示， 尽管以相同的方法处理试样， 表面硫(S)的含量随着与浓硫酸反应时间的增长而增加。另外，磺化后的PEEK在硝酸(浓度约为68%～65%)作用5 min，可降低PEEK表面S的含量。通过高锰酸钾+磷酸蚀刻作用，材料表面也会残留如Mn、P等元素，但是其量基本可以忽略不计。

图 1 各组材料微观形貌图(FE-SEM)Fig 1 Surface morphology of the various samples(FE-SEM)

表 1 XPS测定各组材料元素组成Tab 1 Elements composite of various sample detected by XPS

2.2 骨髓间充质干细胞粘附及伪足数量

未经化学处理的PEEK材材料表面光滑，细胞粘附数量偏少，铺展情况尚可但有少量松散的细胞的伪足(图 2A)。磺化5 min组、磺化10 min组以及磺化5 min+硝酸组处理后形成的3D筛孔状结构，使得材料表面无论是细胞粘附数量还是丝状伪足数量都优于纯PEEK空白对照组(图 2B～2D)。经高锰酸钾+磷酸蚀刻的PEEK材料与对照组相比，细胞粘附数量基本相似，然而细胞伪足的数量要明显优于对照组(图 2E)。

图 2 大鼠骨髓间充质干细胞在不同处理组材料表面培养4 h后的SEM图Fig 2 SEM images of rBMSC grown for 4 h of culture on the material surface of each group

3 讨 论

细胞粘附是细胞与材料相接触的首要生理行为。已有研究表明，材料表面形貌对细胞粘附、增殖和分化起着至关重要的影响[12]。近期研究发现PEEK材料具有良好的力学性能，但其较差的表面生物性能不利于细胞的黏附[6-8,13]。目前，研究人员已经通过多种物理和化学方法对PEEK材料进行了表面处理[7-8,13-17]，均在不同程度上提高了PEEK材料的生物性能。根据PEEK材料的特性，本研究采用了操作较为简单的化学酸蚀处理法，并取得了较好的结果。从电镜结果可见经磺化的S1-PEEK和S2-PEEK材料表面均形成了极为相似的3D筛网状结构，但S2-PEEK的筛网状结构孔径较S1-PEEK明显增大，而S+n-PEEK与S1-PEEK的表面结构则未见明显不同。该结果提示，随着磺化时间的增加，PEEK材料表面的3D筛网状结构也随之增大，但磺化后的PEEK(SPEEK)与硝酸(浓度约为65%～68%)反应则不会改变材料表面形貌。而与对照组相比，尽管Mn-PEEK材料表面并未出现3D筛网状结构，但其独特的微米级花瓣样结构，令其粗糙度明显增加。目前普遍认为材料的三维形貌(大小、形状、表面纹理)均会对细胞造成不同程度的影响[18-19]。进一步体外实验发现，与空白对照组相比，经磺化的SPEEK无论是细胞的粘附数量还是伪足的伸展情况均显示出较强的粘附能力。本研究发现不同磺化时间材料表面形貌会有所不同，但不同硫化时间是否对细胞生物学行为造成不同影响尚需要进一步实验研究。

虽然本研究发现S-PEEK组在表面结构、细胞粘附及伪足数量均优于对照组，但也发现S-PEEK材料表面残留较多的硫(S)，同时会引入磺酸基团(-SO3H)。既往研究证实，硫化混合物二氧化硫(SO2)及SO2衍生物会对人体细胞及DNA氧自由基产生不良影响[19]； 而水浴加热的方式可去除材料表面残余S。本研究发现通过相同水浴加热法处理S2-PEEK(磺化10 min， 100 ℃水浴加热4 h)其含S量较S1-PEEK(磺化5 min， 100 ℃水浴加热4 h)仍会增加，考虑可能磺化10 min进入到PEEK的碳氢骨架的SO3H(磺酸基团)较磺化5 min要多所致。磺化后与硝酸反应再经过水浴处理后S+n-PEEK其含S量较S1-PEEK明显减少，磺化后与硝酸(浓度约为68%～65%)作用5 min随后水浴法处理可减少材料表面的S含量，操作方法简单易完成，同时材料表面形貌不发生改变。经浓度约为68%～65%硝酸处理的S+n-PEEK材料对于骨髓间充质干细胞的初期粘附及伪足数量与磺化的SPEEK并没有什么明显的差异，对细胞的增殖、分化等生物学行为两者会有什么差异目前尚不得而知。另外还发现，Mn-PEEK可得到粗糙表面同时不会残留过多其他元素。综上，初步发现SPEEK或S+n-PEEK及Mn-PEEK细胞粘附及伪足数量均较对照组PEEK材料均显著增多，下一步将对细胞的增殖、分化等生物学行为进行深入研究，为新型PEEK材料广泛应用于临床奠定基础。

4 结 论

通过不同化学法对PEEK材料进行处理，得到不同形貌S1-PEEK、S2-PEEK、S+n-PEEK、Mn-PEEK材料。处理后的PEEK材料表面可形成3D筛网状或花瓣样结构，同时增加细胞粘附且伪足数量显著增多。表明通过化学法处理可改变PEEK材料表面特性进而提高其生物性能。