TGFβ/Smad信号通路在口腔鳞癌热疗中的表达变化

周昊 刘奕 廖楚航 郭骏 费伟

热疗(Hyperthermia)作为一种新兴的治疗恶性肿瘤的方法，副作用较小且无累积。以往的临床研究已经证实热疗在恶性肿瘤晚期、复发性肿瘤和转移性疾病的治疗中都是有效的[1]。虽然热疗对恶性肿瘤的抑制作用已经得到公认，但是其潜在的分子机制仍不清楚。

转化生长因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)是一种多功能细胞因子，它可以通过抑制机体的抗肿瘤免疫应答，从而诱导肿瘤细胞的增殖、转移以及肿瘤组织血管生长[2-3]。Smad蛋白是TGFβ主要的信号传导分子，参与广泛的生物学过程[4]。研究发现，经典的TGFβ/Smad信号系统在上皮源性的恶性肿瘤(包括OSCC)的发生和转移中起着重要的作用[5-7]。而TGFβ/Smad信号系统与血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)-A，促淋巴生成因子VEGF-D和VEGF-R3，促转移因子uPAR和MMP都有着密切的关系，而这些因子的表达已经被证实在热疗的过程中都发生了改变[8-11]。

本课题组前期研究已经证实了热疗可抑制VEGF-C和-D在口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)中的表达[8]。同时，其他的一些基因如VEGF-A、尿激酶受体(Urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR)、凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)以及基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)的表达在热疗的过程中都会发生改变[9-11]，这些结果均提示热疗可能通过改变一些肿瘤相关因子的表达来改变肿瘤生长和转移的特性。但是，TGFβ/Smad信号系统是否在热疗诱导的抗肿瘤机制中起重要的作用还未见相关报道。

本研究拟从基因水平和蛋白水平检测热疗对OSCC动物模型中TGFβ, Smad2, Smad3, Smad4和Smad7表达的影响，初步探寻TGFβ/Smad信号系统在热疗抗肿瘤过程中发挥的作用及其分子学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/C-nu/nu裸鼠，雌性， 4～5 周龄，体重15～20 g，饲养于无特异性病原菌，恒温(20～26 ℃)，恒湿(45%～50%)的空气洁净的层流架内。

1.2 肿瘤模型建立

实验所用口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113购自四川大学口腔疾病研究国家重点实验室；基本实验步骤如下；细胞株从液氮冰存中复苏，培养于RPMI培养液(15%灭活小牛血清，青霉素200 U/ml, 链霉素200 U/ml)， 37 ℃， 5% CO2培养箱。收集对数生长期细胞，制备浓度为1×107/ml细胞悬液，皮下接种于裸鼠双侧臀部，每个部位接种约0.1 ml。待肿瘤体积达到100 mm3，随机将裸鼠分为加热组(HT组)和未加热组(C组)，每组10 只。

1.3 肿瘤加热模型的建立

采用水浴加热法给加热组裸鼠局部肿瘤加热。将荷瘤裸鼠予以戊巴比妥钠镇静后，置于水浴箱内加热，肿瘤置于水面下至少1 cm，加热条件： 42.5 ℃恒温，加热40 min[9]。使用小风扇降温避免全身加热，并保持室内温度恒定。共加热5次(每次间隔7 d)，最后1 次加热7 d后处死裸鼠，同时处死未加热组裸鼠，分离取出肿瘤组织，液氮保存，后转存于-80 ℃冰箱，备用。

1.4 RT-PCR检测

取保存的肿瘤组织磨碎后加入Trizol(50 mg组织加入1 ml)抽提RNA，并用RevertAidTM试剂盒(Thermo, USA)逆转录成 cDNA; 取逆转录产物进行实时荧光定量 RT-PCR(ABI Prism 7700，USA)。引物序列见表 1。

1.5 Western blot检测

表 1 引物序列Tab 1 The sequences of the primers

使用蛋白提取试剂盒(KeyGEN, China)提取肿瘤组织蛋白，BCA蛋白检测试剂盒(Pierce, USA)测定蛋白浓度。蛋白变性后，冷却上样，凝胶电泳半干法转入PVDF膜后置于封闭缓冲液(摇床振荡1 h)，分别加入目标基因一抗(Cell Signaling technology, 1∶10 000, USA)， 4 ℃过夜，TBS/T洗涤后孵育二抗，ECL显影条带并进行灰度分析(Bio-Rad, USA)。

2 结 果

2.1 目标基因mRNA的表达变化

RT-PCR结果显示： 2 组样本中均检测到目标基因mRNA的表达。加热组中TGFβ、Smad2、Smad3的mRNA表达比未加热组明显降低(P<0.05)，Smad7的mRNA表达明显升高(P<0.05)，而Smad4的mRNA表达变化无明显统计学意义(图 1)。

图 1 TGFβ/Smad相关分子mRNA表达的变化(*: P<0.05)Fig 1 The mRNA levels of TGFβ/Smad relative factors (*: P<0.05)

2.2 目标基因蛋白表达的变化

Western blot结果显示：两组中均检测到目标基因蛋白的表达。TGFβ、Smad7、Smad4蛋白的表达变化与mRNA表达变化一致，而Smad2和Smad3的表达无明显变化，磷酸化的Smad2和Smad3(pSmad2和pSmad3)表达则明显降低(P<0.05)(图 2)。

图 2 TGFβ/Smad相关分子蛋白表达的变化(*: P<0.05)Fig 2 The protein levels of TGFβ/Smad relative factors (*: P<0.05)

3 讨 论

TGFβ被认为是一种促肿瘤因子，它可以促进上皮细胞间质转型(Epithelial-mesenchymal-transition, EMT)，而EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤获得侵袭和迁移能力的重要生物学过程[12]，另外TGFβ还能够通过自分泌和旁分泌机制，激活促转移因子如VEGF、FGF、uPAR、MMP2/9 和 VEGFR3的表达，从而在恶性肿瘤的发生和转移中发挥重要作用[13-15]。Smad蛋白是TGFβ唯一的直接转录因子，它作为TGFβ主要的细胞内介导分子，参与了广泛的生物学进程[9]。现有8 种Smad蛋白被发现，TGFβ/Smad 信号通路包括R-Smad(Smad2和Smad3)、Co-Smad(Smad4)、I-Smad(Smad7)。研究证实，TGFβ/Smad信号系统在肿瘤的发生和转移中扮演重要的角色[2，7，12]。

肿瘤细胞比正常细胞对于温度更敏感，加热可以使其内皮细胞破裂，增加血管壁的粘附性以及血液的粘稠度， 继而致血栓形成，最终导致肿瘤组织的破坏，热疗就是基于以上原理达到治疗的作用[16-17]，其分子学机理还不清楚。本课题前期研究结果发现热疗能够抑制淋巴转移因子VEGF-C和VEGF-D的表达[8]。本研究中检测了热疗后OSCC动物模型中TGFβ/Smad信号系统相关因子的表达变化，初步探寻TGFβ/Smad信号系统在热疗对恶性肿瘤治疗过程中所起的作用。结果显示，对荷瘤裸鼠进行加热后，肿瘤细胞中TGFβ、Smad2和Smad3的mRNA表达降低，Smad4的表达无明显变化，而Smad7的表达明显升高；蛋白的检测结果略有不同，TGFβ、Smad4和Smad7的表达表达变化与mRNA表达一致，不同的是在加热过后Smad2和Smad3的表达没有变化，而 pSmad2和pSmad3的表达降低。在经典的TGFβ/Smad信号传导通路中，TGF-β首先激活II型受体(typeII TGF-β receptor, TβRII)，随后磷酸化I型跨膜受体(TβR I)，活化的TβRII再磷酸化R-Smad(Smad2和Smad3)，R-Smad的非活性发夹结构活化之后与Smad4结合形成复合物进入细胞核，通过直接或者间接与DNA结合，与不同转录因子相互作用从而调控各种生物学效应[4]。Xie等[18]对798例头颈部鳞状细胞癌样本进行检测，发现Smad蛋白活性未受损的患者5年生存率大概为45%，而缺失pSmad2和pSmad3表达的患者5 年生存率为90%。这说明了磷酸化的R-Smad对于TGFβ/Smad信号的促肿瘤效应至关重要。本研究发现加热之后pSmad2和pSmad3的蛋白表达降低，而Smad7的表达明显升高。Smad7作为抑制型Smad(I-Smad)在TGFβ/Smad信号通路中起着抑制R-Smad磷酸化的作用，它可以竞争性抑制磷酸化Smad2/3和与TβRⅠ形成稳定的复合体，Smad7还能与Smad泛素调节因子(Smad ubiquitinregulatory factors, Smurfs)结合抑制R-Smad磷酸化，从而抑制TGFβ信号[19-21]。TGFβ/Smad信号系统在热疗过程中可能是通过上调Smad7的表达，从而抑制Smad2和Smad3的磷酸化而达到抑制TGFβ所介导的促肿瘤效应。

综上所述，TGFβ/Smad信号系统在热疗所产生的抗肿瘤效应中扮演着特定的角色，而Smad7对R-Smad磷酸化的抑制作用可能起着某种关键作用。