循环microRNA在骨折损伤中的研究进展及法医学应用

高如阳 陈亮

骨折在死亡和人身伤害案（事）件的司法鉴定中常见，其被关注的焦点在于骨折的部位、时间以及性质。[1]骨折是指骨结构的连续性完全或部分断裂。骨组织具备较强的再生能力，骨折后最终也可以达到完全愈合。骨折损伤的形成和修复与许多因素有关，这些因素是鉴定过程中需要考虑的问题；[2]而目前的鉴定主要根据X线影像学技术、CT及MRI技术，但其诊断的准确性相当程度上取决于鉴定人的诊断经验，因此寻求一种更加精确的、客观的鉴定新技术以提高对之鉴定的准确性，便成为法医鉴定工作的迫切需求。近年来，miRNA被视为生物医学领域的“金矿”，国内外大量的研究数据表明miRNA与骨折的过程密切相关。[3]随着科学技术的不断发展，将循环miRNA应用到司法鉴定过程中成为了可能。本文拟就循环miRNA在骨折损伤过程中的研究进展及法医学应用作以下阐释。

一、循环miRNA简介

miRNA是一类内源性的具有调控作用的RNA，最初在线虫的体内发现，[4]后来发现在动物、植物基因组中都有表达。[5]miRNAs基因的转录在细胞核内，由RNA聚合酶II介导，最初转录产物为原始miRNAs（pri-miRNAs）；而 pri-miRNAs在 核 酸 酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被切割为约70个nt组成的前体microRNAs（pre-microRNAs），进而在核质／细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，将pre-microRNAs输送到细胞质中，随后又在核酸酶Dicer的作用下，被剪切成为大约22个nt长度的双链miRNA分子；双链miRNA分子进入沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)中，只有其中成熟的miRNA分子留在复合体中；而成熟的microRNAs能够结合到与其互补的mRNA的位点，经过碱基配对调控基因表达。[6]

“循环miRNA”是指在血清、血浆等体液中稳定存在的miRNA分子，其具有取材方便、灵敏度高的特性。[7]研究数据显示经过反复冻融或室温放置24小时的血浆样品，其miRNA的含量与新鲜的血浆miRNA含量无显著性差异。循环miRNA作为一种体液检测的生物学标记物，具有易于检测、相对无创的特点。[8]由于miRNA的长度、组织特异性以及在扩增中的相对稳定性,循环miRNA展示出了巨大的应用前景。[9]随着研究进展的不断深入，大量数据表明，循环miRNA参与人体多种调节，包括细胞生长、发育、增殖和凋亡、多种肿瘤和疾病的发生发展、机体各个系统的功能等[10],是目前一种比较理想的生物学标志物。[11]

二、循环microRNA在骨折损伤中的研究

骨折的愈合过程极其复杂，是分子层面、多种细胞、不同组织和各种器官间相互作用的结果，其具体包括炎症反应、细胞增殖和分化、血管生成和重建、骨痂的形成等，[12]再加之由于骨折的部位、时间、性质不同，诸因素都给法医鉴定工作带来一定的难度。目前，已有部分研究发现与骨折部位相关的microRNA，但是尚未发现其与损伤时间的确切相关性。

（一）髋部骨折

随着人们生活水平的不断提高，人口老龄化[13]是我国目前一个重要的社会问题，成为威胁人类健康的重要因素。而髋部骨折，尤其是在老年女性中更容易发生，[14]再加上老年人的基础疾病较多，因此治疗这种疾病成为了临床工作的难点[15]。Chen Xiaobin等通过建立老年大鼠髋部骨折的模型，取骨折后24h、48h、72h血液进行芯片的检测，结果发现13个异常表达microRNA,其中差异最大两组：microRNA-130a-3p表达下调，microRNA-150a-5p上调，其结果在肺组织中也得到了验证。[16]上述发现填补了髋部骨折中循环microRNA研究的空白，为老年髋部骨折患者的诊断提供了潜在生物标志物，在法医学的骨折损伤时间鉴定中的应用有待进一步的研究。

（二）股骨骨折

股骨骨折又被称为“股骨干骨折”。造成股骨骨折原因大多是强烈的暴力所致，好发于青壮年，男性多于女性。Waki Takahiro等[17]在股骨干骨折标准愈合组和未愈合组的第14天的基因芯片和荧光定量中的研究发现五个差异表达的microRNA:miR-140-3p，miR-140-5p，miR-181a-5p,miR-181d-5p和miR-451a,其可能在骨折愈合的过程中发挥着重要作用。Sylvia Weilner[18]等在绝经后的女性股骨骨折的血液中提取microRNA，发现可能与骨折愈合相 关 的 6 个 microRNA:miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-133b、miR-22-3p、miR-328-3p 和 let-7g-5p。Koichi Murata[19]等在股骨转子间骨折的患者与正常对照组中发现，血浆miR-91a在骨折后的24小时内显著下降，为了验证miR-91a对骨折的影响，在小鼠的体内注射抗miR-91a，发现骨痂量明星增多，促进了骨折的愈合。在股骨骨折的不同时间中循环microRNA的表达有着不同的研究结果，在损伤时间的推断中的应用有待进一步的研究。

（三）踝关节骨折

踝关节骨折作为一种常见的骨折[20]，大多由间接暴力引起，例如交通事故、摔跌、扭伤等，青年人群中尤其多见。Deping Sun[21]选取了28例临床上踝关节骨折的病人，其中15例在骨折后的1～7天内接受手术治疗，13例在骨折后的8～14天内接受手术治疗。手术当天提取血液microRNA,发现与1～7天手术组相比，8～14天手术组踝关节血液组织中miR-185表达水平明显降低，其结果也在骨组织中得到验证,miR-185通过调节TGF-β1的表达，从而抑制成骨细胞的增值，与骨的表达调控密切相关。基于上述实验结果，将为踝关节骨折损伤时间推断提供新的生物学标记物。

（四）胫腓骨骨骨折

胫腓骨骨折多见于中青年男性，[22]胫骨骨折约占四肢长骨骨折的3%～4%，[23]由直接暴力引起。Zou L[24]等在胫骨远端干骺端骨折的患者血液中发现，miR-124-3p与BMP6mRNA表达水平呈负相关。而BMP6可以促进细胞凋亡，抑制骨折的愈合，因此miR-124-3p表达量升高对骨折愈合则呈正向的促进作用，可以作为一种预测以及治疗胫骨远端干骺端骨折愈合的生物标志物,但是目前尚未有关于其在骨折损伤不同时间中表达量变化的相关数据，因此其作为胫腓骨骨折的特异性生物学标记物在法医骨折损伤时间的推断有待进一步的研究。

（五）肱骨骨折

Chunfang Ju[25]等在肱骨骨折的患者中发现，骨折后8-14天接受手术的患者比骨折后1～7天接受手术的患者血液中的miR-421相对表达量明显降低，双荧光素酶结果显示BMP-2是miR-421的直接作用的靶基因。进而可以推断miR-421可能是通过BMP-2来对肱骨骨折进行修复。至于循环miR-421是否可以应用到骨折的损伤的领域有待进一步的验证。

（六）手部骨折

手部骨折，在生活中常见，以老年人为主，多为跌倒时掌部着地所致。徐栋[26]在临床上选取手部骨折的患者，于损伤后24小时内抽取血浆，同时在固定后的7天、14天、21天分别抽取血浆，用正常人的血浆作为对照。研究数据发现血浆miR-28-3p的相对表达量在固定后的14天、21天有了显著下调，统计学分析其与骨折愈合存在负相关，为骨折损伤时间的推断提供了新的生物学标记物。但是其表达量与损伤时间的关系，是否可以推导出相关数学模型，为法医鉴定提供客观的依据，有待进一步的研究和验证。

（七）脊柱骨折

Ahn Tae-Keun[27]等通过对绝经后女子的骨质疏松性椎体压缩性骨折的易感性研究中发现，miR-146a,miR-149,miR-196a2和miR-499的多态性与之相关，可以作为预测易感性的一种指标。由于脊柱骨折的循环microRNA的研究数据较少，尚无循环microRNA特异性的表达及与损伤时间的相关报道，因此在日后则需要更多地关注于这方面的研究。

三、循环microRNA在法医骨折时间鉴定中的应用及展望

综合以上的研究结果不难发现循环microRNA在骨的代谢、发育、修复等方面正发挥着重要的作用。[28]大量的研究数据显示，一种或多种循环microRNA有可能作为特定骨折损伤部位的生物学标记物，在临床的诊断和治疗中发挥巨大的潜力。[29]目前循环microRNA在骨折损伤领域的研究成为热点，但是尚未有循环microRNA在法医损伤领域应用的报道，相信随着分子生物学技术的不断发展，将会发现骨折损伤部位及随着骨折损伤时间表达的特异性的循环miRNA，为骨折损伤的鉴定提供新的方法。在法医实践中，骨折部位确定、时间推断、性质判定是其重要内容，不仅在新旧骨折判定、损伤程度确定发挥着重大作用，同时也在损伤时间、死亡时间和骨折发生后的存活时间推断，以及死亡原因、损伤方式、命案现场分析等多个方面提供重要的技术支撑。对申请损伤鉴定的被鉴定人来说，准确地判断损伤的具体时间，往往涉及案件具体确定侵害人、侵害车辆，以及后期所需的营养期、误工期、护理期等赔偿费用的确定。对于死亡案（事）件而言，骨折损伤鉴定则是服务于案件定性、确定嫌疑人的需要，以及为法庭诉讼提供诉讼依据。因此一种客观精确的鉴定方法，是司法实践、维护社会公平正义的迫切需求。而循环microRNA作为一种小RNA可以稳定地存在，对于一些微量的检材更有价值，相信随着科学技术的不断发展，microRNA将会应用到法医学的领域，为司法鉴定提供更加客观的依据。