锦灯笼提取物对6种植物病原真菌的抑制作用研究

杨春，李婷，蒋凌芸，郅晓燕，王熠，曹挥

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

在现阶段的植物病害防治过程中，尽管化学合成农药仍发挥着重要的作用，但其在长期使用过程中暴露出来的农药残留、抗药性加剧、环境污染等问题已日趋严重[1]。因此，寻找和开发安全高效、低残留、环境友好的新型植物病害防护剂已显得十分迫切。其中，自然界植物在长期进化和生命过程中会产生诸多抵御病虫害入侵的手段，而大多数的防御作用是通过其生命过程中产生的多种活性代谢物质来实现的[2，3]。以这些活性次生代谢物为基础开发新型植物源农药相比于传统合成农药具有诸多的优点[4，5]，如：(a)选择性强，作用靶标专一，对非靶标生物安全；(b)次生代谢物源自植物的生命过程中，环境兼容性好，在自然界中更易被降解；(c)基于植物长期进化的复杂性和多样性，活性代谢物种类繁多，作用方式特异，有害生物不易产生抗药性等。因此，以自然界中具有药理作用的植物为研究材料，发掘具有农用生物活性的天然物质，开发安全性高、残留量低以及环境相容的植物源农药，是当前新型植物病虫害防护剂的一个发展趋势[6～8]。

锦灯笼，又名红姑娘、红灯笼、灯笼果、挂金灯等，为茄科植物酸浆(PhysalisalkekengiL. var.franchetii(Mast.)Makino)的干燥宿萼或带果实的宿萼，广泛分布于中国、俄罗斯、日本以及朝鲜半岛等欧亚大陆[9]。其干燥的宿萼或带果实的宿萼具有清热解毒、利尿、利痰等作用[10]。此外，现代研究表明其体内含有丰富的甾体、黄酮、生物碱以及单萜类等多种次级代谢产物[11，12]，这些次级代谢产物表现出优良的抗菌[13～16]、抗氧化[17]、抗癌[18]、消炎[19]、镇痛和利尿[20，21]等药用活性。但现阶段关于其对植物病原真菌的抑制作用还未见报道，因此，本文以锦灯笼干燥带果实的宿萼为研究材料，测试其粗提物对供试植物病原真菌的抑制效果，旨在筛选出高活性的抑菌物质。本研究具有较强的新颖性和潜在的应用价值，可为进一步开发新型绿色植物源抗菌剂提供试验和理论依据，同时也符合当前农业生产中“减肥减药”的绿色发展理念。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

药品及试剂：葡萄糖，琼脂粉，丙酮，乙酸乙酯，石油醚(沸程60～90 ℃)，无水乙醇，吐温-80，98%多菌灵原药等(均为市售分析纯)。

供试材料：锦灯笼(干燥带果实的宿萼)，购于河北安国药材市场。

供试植物病原真菌：苹果树腐烂病菌(ValsamaliMiyabe et Yamada.)、梨黑斑病菌(AlternariakikuchianaTanaka)、茄子枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp. melonganae)、苹果树干轮纹病菌(Botryosphaeriaberengerianaf. sp. piricola)、番茄早疫病菌(Alternariasolani(Ell. et Mart)Jones et Grout)和葡萄圆斑根腐病菌(Fusariumspp.)。以上病原菌均保藏于山西农业大学农学院植物病理学实验室，活化后即可使用。

供试植物：未成熟的番茄果实(为“宝石十二”感病品系，采摘于山西省太谷县山西农业大学大学生创业园)。

主要仪器：FDV型气引式粉碎机(台湾佑崎有限公司)；IKA RV 10 digital V 型旋转蒸发仪(艾卡广州仪器设备有限公司)；SHB-B95型循环水式多用途真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；SW-CJ-ID型单人净化工作台(苏州净化设备有限公司)；GR-240型热空气消毒箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SPX-150型生化培养箱(上海皓庄仪器有限公司)等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料的预处理

将购得的锦灯笼药材在室温条件下阴干，粉碎机粉碎，过60目筛，将药材粉末密封后置于冰箱中保存备用。

1.2.2 锦灯笼四种溶剂粗提物的提取[22，23]

称取4份上步制备的药材，每份500 g，装入相应编号的浸提缸内，分别加入药粉3倍体积量的石油醚、乙酸乙酯、丙酮和蒸馏水，搅拌使药粉和溶剂充分接触。将提取缸置于超声波提取仪中30 ℃条件下超声波辅助提取1 h，待恢复至室温后取出，室温条件下浸提3 d。分别抽滤，滤渣再次装入提取缸中，加入相应的溶剂，再重复上述操作两次，合并相应溶剂的滤液，经旋转蒸发仪减压浓缩后分别得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、丙酮提取物和水提物。称重并采用公式1计算提取率，密封后置于冰箱中保存备用。

(1)

1.2.3 锦灯笼4种溶剂粗提物的初步抑菌活性测定

采用菌丝生长速率法[24，25]初步测试2 g·L-1的不同提取物对6种供试病原菌的抑菌活性，待空白对照组菌落直径达到培养皿直径的2/3以上时，采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，同时采用公式2计算抑菌率。

抑菌率/%=

(2)

1.2.4 锦灯笼乙酸乙酯提取物对供试病原菌的毒力测定

分别设置浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、9.0 g·L-1五个梯度，制成相应的带毒培养基。其余操作同1.2.3，最终分别求出锦灯笼乙酸乙酯提取物对6种供试病原菌的毒力方程和EC50值等。

1.2.5 锦灯笼乙酸乙酯提取物对活体番茄早疫病菌的防效研究[26～28]

1)药液的配制：称取一定量的锦灯笼乙酸乙酯提取物，加入少量的丙酮溶解，再用事先配制的0.1%吐温-80水溶液稀释至10 g·L-1，低温保存备用。阳性对照药剂多菌灵可湿性粉剂直接用无菌水稀释至0.1 g·L-1备用；2)供试植物材料番茄果实的消毒：将新采摘未成熟的番茄果实洗净，然后依次用无菌水冲洗、70%酒精擦拭表面，最后用无菌水反复冲洗3次，自然晾干，置于无菌操作台中灭菌备用；3)预防组接菌及施药：将配制的锦灯笼乙酸乙酯提取物药液和阳性对照药剂药液均匀喷洒于番茄果实表面(每个果实喷洒3～5 mL，药液均匀覆盖即可)，自然晾干，用砂纸在果实表面等距离创造两个4 mm大小的伤口，将活化好的番茄早疫病菌菌饼接种于伤口处，放入铺有脱脂棉的培养皿中，加入一定量的无菌水后保鲜膜密封(每皿一个番茄，每个药剂重复5次)，之后置于温度(25 ± 1) ℃、湿度60%～80%的培养箱中培养6 d；4)治疗组接菌及施药：将未用药剂处理的果实按上步方法接菌，3 d后待菌斑直径达到一定大小时，将配制好的待测药液和阳性对照药剂均匀喷洒于发病的番茄果实表面，其余操作同上，培养3 d后检查结果；5)结果检查及统计分析：待病菌在番茄果实上生长约6 d后，采用十字交叉法测量各自的病斑直径，分别按公式3计算药剂对番茄早疫病菌的防治效果和治疗效果。

防治效果或治疗效果/%=

(3)

1.3 统计分析

抑菌活性数据通过SPSS Statistics 17.0软件统计分析，其中各提取物对供试病原菌的抑菌活性差异显著性分析采用邓肯氏新复极差法(Duncan’s multiple range test)在P<0.05水平下得到。

2 结果与分析

2.1 锦灯笼不同溶剂的提取率

本研究分别选取了4种不同极性的溶剂来提取锦灯笼中的活性成分。从表1可以看出，极性溶剂(乙酸乙酯、丙酮和水)相比于非极性的石油醚，提取率要高出许多，而极性相似的乙酸乙酯和丙酮其提取率也基本相同。说明极性溶剂更有助于锦灯笼粗体物的提取，但是极性溶剂是否有助于抑菌活性物质的提取还有待于后续的进一步研究。

表1 4种不同溶剂对锦灯笼的提取率

Table1 The extraction yields ofPhysalisalkekengiby four different solvents

溶剂Solvent提取物性状Extract properties提取率/%Extraction yield石油醚淡红色膏状物1.80乙酸乙酯红色稠膏状物5.18丙酮红色稠膏状物5.20水红色膏状物6.34

2.2 2 g·L-1的锦灯笼4种溶剂提取物对6种供试病原菌的离体抑菌活性

本试验首先用2 g·L-1的4种溶剂锦灯笼提取物初筛对6种供试植物病原菌的室内抑菌活性。从表2中的数据以及通过对活性数据进行差异显著性检验可以发现：其乙酸乙酯提取物对6种供试植物病原菌均有一定的抑制效果，尤其对苹果树腐烂病菌和番茄早疫病菌的抑制效果最为明显，分别达到了73.53%和83.41%。通过差异显著性检验也可以发现，锦灯笼乙酸乙酯提取物对供试病原菌的抑菌率与其它溶剂提取物的抑菌率均存在显著的差异，其抑菌效果最为突出。锦灯笼丙酮和水的粗提物对供试菌抑制活性一般，最高者仅为51.03%；石油醚提取物对6种供试病原菌的抑菌作用均比较微弱。此试验说明，锦灯笼乙酸乙酯提取物具有较好的抑菌活性，因此，选取锦灯笼乙酸乙酯提取物进一步求出其对6种供试病原菌的毒力回归方程，以及抑制中浓(EC50)等。

表2 2 g·L-1的锦灯笼不同溶剂提取物对6种供试病原菌的的抑制作用/%

Table2 Inhibitory effects of different solvent extracts fromPhysalisalkekengiagainst six tested phytopathogenic fungi with a concentration of 2 g·L-1

供试提取物Test extracts96 h抑菌率Inhibition rate at 96 h苹果树腐烂病菌Valsa mali梨黑斑病菌Alternaria kikuchiana茄子枯萎病菌Fusarium oxysporum苹果树干轮纹病菌Botryosphaeria berengeriana番茄早疫病菌Alternaria solani葡萄圆斑根腐病菌Fusarium spp石油醚提取物6.76±0.15d25.93±0.14b18.40±0.01c10.50±0.09b23.28±0.03c27.08±0.01c乙酸乙酯提取物73.53±0.04a38.75±0.01ab63.31±0.01a40.35±0.67a83.41±0.10a55.42±0.02a丙酮提取物51.03±0.22b44.12±0.01a44.69±0.04b10.68±0.67b37.45±0.04b35.01±0.03b水提物25.83±0.02c31.25±0.01ab4.76±0.06d5.81±0.12c34.69±0.39b30.76±0.03b

注: 表中数据后的同列字母不同表示经邓肯氏新复极差法检验二者之间差异显著(P<0.05)。

Note：Different letters indicated significant difference by Duncan′s multiple range test in same column (P<0.05).

2.3 锦灯笼乙酸乙酯提取物对供6种试病原菌的毒力

通过浓度梯度法求取锦灯笼乙酸乙酯提取物对各供试病原菌的毒力回归方程。从表3可以看出，锦灯笼乙酸乙酯提取物对6种供试病原菌均有一定的抑制作用。其中，对番茄早疫病菌的抑制作用最为突出，EC50达到了0.79 g·L-1；其次，该提取物对苹果树腐烂病菌和葡萄圆斑根腐病菌也有较强的抑菌作用，EC50分别为1.30 g·L-1和1.44 g·L-1；对茄子枯萎病菌、梨黑斑病菌和苹果树干轮纹病菌的抑制作用相对较差，EC50分别2.58、3.75、4.40 g·L-1。总之，此试验结果表明锦灯笼乙酸乙酯提取物对6种供试病原菌均有一定的抑制活性，尤其对番茄早疫病菌具有较强的离体抑菌活性。尽管与传统的化学合成抑菌剂相比，该抑菌活性可能不是特别突出，但是作为新型的植物源提取抗菌剂来说活性已经比较优异。因此，有必要深入研究其对活体植株或器官上寄生的番茄早疫病菌的抑制效果，以验证该提取物抗菌活性的适应性，进一步发掘其潜在的应用价值。

2.4 锦灯笼乙酸乙酯提取物对活体上番茄早疫病菌的抑制效果

10 g·L-1的锦灯笼乙酸乙酯提取物对番茄早疫病菌具有良好的预防效果和治疗效果，能有效阻止病斑的生长扩大(图1)。对于先施药后接菌的预防组而言，在病斑生长的第4 d开始测量统计数据，发现其预防效果均达到50%以上，同阳性对照药剂多菌灵相比，其预防效果也比较明显，说明10 g·L-1的锦灯笼乙酸乙酯提取物对番茄果实上的早疫病菌具有较好的预防作用；对于治疗组而言，10 g·L-1的锦灯笼乙酸乙酯提取物同样对发病果实具有较高的治疗效果，在第5 d时甚至达到了70.1%，与阳性对照药剂相当(表4)。

3 讨论与结论

本研究首先选择了4种常见的溶剂来浸泡提取锦灯笼中的活性成分，发现3种极性溶剂(乙酸乙酯、丙酮和水)的提取率较高。同传统的回流提取法[20]相比，浸提法可以减少提取时对有效成分的破坏，是一种研究药用植物活性组分时比较适用的方法。

表3 锦灯笼乙酸乙酯提取物对6种供试病原菌的的毒力Table 3 The toxicity of ethyl acetate extract from Physalis alkekengi against six tested phytopathogenic fungi

图1 第6天时10 g·L-1锦灯笼乙酸乙酯提取物番茄早疫病菌的预防(左图)和治疗(右图)效果(CK：空白对照；Treat：10 g·L-1锦灯笼乙酸乙酯提取物处理；CB：0.1 g·L-1多菌灵处理)Fig.1 Protective(left)and Therapeutic(right)effects of ethyl acetate extract from Physalis alkekengi against Alternaria solani with a concentration of 10 g·L-1 at 6th day in vivo(CK：blank control group；Treat：The ethyl acetate extract from Physalis alkekengi with a concentration of 10 g·L-1；CB：carbendazim)

Table4 The control efficiency of ethyl acetate extract fromPhysalisalkekengiagainstAlternariasolaniwith a concentration of 10 g·L-1

时间Time预防效果Protective effects治疗效果Therapeutic effects10 g·L-1 锦灯笼乙酸乙酯提取物10 g·L-1 ethyl acetate extract0.1 g·L-1 多菌灵0.1 g·L-1 carbendazim10 g·L-1 锦灯笼乙酸乙酯提取物10 g·L-1 ethyl acetate extract0.1 g·L-1 多菌灵0.1 g·L-1 carbendazim第4天55.88 ± 0.3252.94 ± 0.2968.63 ± 0.4960.26 ± 0.22第5天55.67 ± 0.2954.64 ± 0.2870.10 ± 0.4666.67 ± 0.46第6天51.58 ± 0.2458.95 ± 0.3165.26 ± 0.3867.01 ± 0.42

为了明确哪种溶剂提取物能最大程度的提取活性成分，进而测试了其在2 g·L-1浓度对6种供试植物病原菌的室内抑菌效果，结果发现乙酸乙酯提取物的抑菌效果最为突出，2 g·L-1浓度下对所有供试菌的抑菌率均超过了40%，其中对苹果树腐烂病菌和番茄早疫病菌的抑制作用最为明显，高达73.53%和83.41%。因此，初步选定乙酸乙酯可以作为提取锦灯笼抑菌活性物质的理想溶剂。前人研究锦灯笼的抗细菌活性，多采用了水或者乙醇为提取溶剂[13, 14]，而本文研究发现采用乙酸乙酯可以最大程度的提取其抗真菌活性组分，而其水提物的活性却比较差。可能的原因是分别采用水和乙酸乙酯提取，得到的提取物成分差异比较大，张楠等[11]报道乙酸乙酯提取物主要包含多种酸浆苦素类物质，而水提物可能主要为多种色素和糖类，这与本文得到的结果是一致的。

同时进一步采用浓度梯度法测定锦灯笼乙酸乙酯提取物对6种供试病原菌的室内离体毒力，发现其对番茄早疫病菌的毒力最强，EC50达到了0.79 g·L-1；对苹果树腐烂病菌和葡萄圆斑根腐病菌也有较强的抑菌作用，EC50分别为1.30 g·L-1和1.44 g·L-1，而对其余3种供试菌则表现出相对较弱的抑制作用。此部分结果说明锦灯笼乙酸乙酯提取物具有较强且广泛的抗植物病原真菌活性，也填补了锦灯笼抗真菌作用研究领域的空白。

为了验证锦灯笼提取物对活体上寄生的植物病原菌是否具有同样的抑制能力，试验选取离体抑菌活性最好的番茄早疫病菌为供试病原菌，测试了10 g·L-1锦灯笼乙酸乙酯提取物对番茄果实上寄生的早疫病菌的防治效果。结果发现该提取物对番茄早疫病菌同时具有较好的预防效果和治疗效果，第4～6天的预防效果和治疗效果分别达到了50%和65%以上，与商品化对照药剂多菌灵相比，其活体防治效果也比较优异。通过本阶段的研究，证实了锦灯笼乙酸乙酯提取物优良的离体和活体抗植物病原真菌能力，也进一步挖掘了其应用潜力。

综上所述，尽管已有文献报道了锦灯笼的抗细菌活性，而本文的研究更进一步证实了锦灯笼宿萼中拥有明显的抗植物病原真菌活性物质，丰富了锦灯笼的生物活性谱。这些抑菌活性物质对离体培养和活体寄生的植物病原菌都具有较强的抑制作用，具备进一步开发成植物源抗菌剂的潜力。本试验结果虽然说明锦灯笼宿萼提取物对植物病原真菌也具有良好抑制作用，进一步证实了锦灯笼体内存在抑菌活性物质，但是只测定了锦灯笼粗提物的抑菌活性，对其具体抑菌成分以及初步的抑菌作用机理等均没有涉及，还有待于进一步深入研究探讨。