基于P53/Bbc3/BCL-2信号转导通路的映山红花总黄酮在大鼠心肌损伤保护中的机制研究

张晓春，童有福，张晓花

由动脉粥样斑块破裂或冠状动脉（冠脉）介入手术过程中形成的微小栓子引起的心肌损伤是临床上常见的现象，有研究报道称冠脉介入术后引起的继发性冠脉微栓塞发生率高达15%～20%，高危患者甚至高达45%左右[1,2]，由此可见冠脉微栓塞现状不容忽视。冠脉微栓塞一旦形成心律失常及局部或大面积心肌梗死便会发生，严重影响了患者的生存期和远期预后。既往研究表明[3,4]，冠脉微栓塞发生后梗死区域心肌细胞发生明显的凋亡，细胞水肿，间质纤维增生，分子层面上凋亡相关蛋白水平显著提高。亦有研究表明[5,7]，抑癌基因P53（P53）、BCL-2绑定组件3（Bbc3）及B细胞淋巴瘤样因子-2（BCL-2）分子在心肌损伤过程中扮演着重要的角色，P53可介导BCL-2相关线粒体凋亡通路调控心肌细胞的凋亡过程。新近研究表明[9,10]，映山红花总黄酮具有心肌损伤的保护作用，但是否通过影响P53、Bbc3和BCL-2分子的水平发挥保护作用的机制尚不十分清楚。本研究主要观察造模后心肌细胞改变及各组心肌组织内P53、Bbc3及BCL-2的表达水平来间接反映对心肌的保护作用和机制探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组雄性SD大鼠40只，机体健康，体重约200～250 g，购于我院动物实验中心。采用随机数字表法将40只大鼠分成正常组、假手术组，模型组+生理盐水组及模型组+映山红总黄酮组，每组10只，其中4只用于免疫组织化学染色心肌组织样本的获取，6只用于Western blot心肌组织样本的获取。所有动物均保证24 h自由食水，12 h日光灯昼夜循环，室温23±1℃，相对湿度40%±5%。所有实验均在我院伦理委员会审批下进行。

1.2 设备与试剂映山红花总黄酮购买于安徽合肥合源医药科技有限公司，黄色粉末状，纯度高达85%，给药时采用生理盐水配制使用。丙泊酚注射液：20 ml，200 mg/支，英国阿斯利康制药公司；45μm聚乙烯微栓塞球：5×105μ/ml，美国Polyscience公司；十二烷基硫酸钠：500 g/瓶，上海生工生物工程有限公司；注射用青霉素钠：0.48 g（80万单位），山东鲁抗医药股份有限公司；小鼠抗P53 IgG（美国Cell Signaling Technology公司），山羊抗BbC3 IgG（美国Cell Signaling Technology公司），兔抗BCL-2 IgG（美国Cell Signaling Technology公司），小鼠抗β-actin IgG（美国Cell Signaling Technology公司），针对小鼠、山羊和兔的辣根过氧化物酶（HRP，北京中杉银桥生物科技有限公司）；HE染色试剂盒（美国Sigma公司），天狼星染色试剂盒（美国Sigma公司），Western blot试剂盒（上海康成生物科技有限公司）。

1.3 模型制备及给药方法10 mg/kg丙泊酚尾静脉注射将各组大鼠诱导麻醉，0.8 mg/kg/min微量泵持续给药。固定大鼠，连接大鼠呼吸机，调整参数为呼吸比1:1，气压1.5 kPa，频率70 次/min，潮气量20 ml/kg。冠脉微栓塞模型主要经历备皮、消毒、铺巾、打开胸腔、暴露心脏、剥离心包、左室注射0.1 ml含45μm聚乙烯微栓塞球4000 U的SDS生理盐水混液同时将升主动脉夹闭20个心动周期（约10 s），假手术组仅为0.1 ml的SDS生理盐水，完毕松开动脉夹，关闭胸腔，逐层缝合，尾静脉注射10 000 U青霉素，撤离呼吸机和麻醉设备，待其自然苏醒恢复后拔除导管，记录实验时间，根据既往研究报道约6～12 h为心肌损伤高峰，因此本研究获取8～9 h间的心肌组织样本。本研究给药方式为预防性给药，在大鼠造模前1周，模型-映山红花组给与映山红花总黄酮干预，浓度为12 mg/kg[11]，腹腔注射，1/d；模型-生理盐水组给与生理盐水治疗。

1.4 免疫组织化学染色与Western blot术后8 h，将各组大鼠水合氯醛（0.4 ml/kg，腹腔注射）审麻。用于免疫组织化学染色的大鼠采用4%多聚甲醛溶液灌注固定，获取心肌细胞，冰冻切片，片厚25 μm。将切片裱至干净的盖玻片，待自然晾干后，置于HE和天狼星染色试剂盒中染色。用于Western blot的大鼠待深麻后于冰上迅速处死，获取心肌组织加入含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的强力RIPA裂解液中，研磨提取蛋白，并进行蛋白定量，采用Western blot试剂盒进行目标蛋白的分离。所有操作均按照试剂盒使用说明严格执行。

1.5 统计学方法所有数据均采用SPSS 13.0统计学软件分析，图表制作采用Graphpad Prism 5软件。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间差异采用两独立样本的t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后大鼠心肌细胞形态改变天狼星染色结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，部分出现纤维断裂的情况；HE染色结果显示，模型组大鼠心肌细胞出现凋亡现象，结构紊乱（图1）。

2.2 各组大鼠心肌细胞形态改变天狼星染色结果显示，与正常对照组相比，假手术组大鼠心肌梗死面积无显著差异（P＞0.05）；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，梗死面积显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；给与映山红花总黄酮干预后，心肌梗死面积显著降低（图2，P＜0.05）。

2.3 各组大鼠心肌组织中P53、Bbc3及BCL-2的表达水平Western blot检测结果提示，与正常组（假手术组）相比，模型组P53、Bbc3及BCL-2的表达水平均明显增加（P均＜0.05），给与映山红花总黄酮可显著抑制组织中P53、Bbc3及BCL-2的表达水平（P均＜0.05）（图3）。

图1 造模后大鼠心肌细胞形态改变

图2 各组大鼠心肌细胞形态改变

3 讨论

图3 各组大鼠心肌组织中P53、Bbc3及BCL-2的表达水平

心肌细胞损伤凋亡的机制尚不十分清楚，目前主要认为心肌细胞缺血后诱发自身凋亡，因此凋亡分子发挥了关键的作用。P53、Bbc3和BCL-2分子是心肌损伤过程中扮演着重要凋亡分子，P53可介导BCL-2相关线粒体凋亡通路调控心肌细胞的凋亡过程[12]。新近研究表明[9,10]，映山红花总黄酮具有心肌损伤的保护作用，但是否通过影响P53、Bbc3和BCL-2分子的水平发挥保护作用的机制尚不十分清楚，本研究将40只大鼠随机分成正常对照组，假手术组，模型组+生理盐水组及模型组+映山红总黄酮组；采用冠脉微血栓方法构建大鼠心肌损伤模型，免疫组织化学染色观察造模后心肌细胞改变，Western blot检测各组心肌组织内P53、Bbc3及BCL-2的表达水平。

既往研究表明[13]，端粒寡核苷酸序列对大鼠胸大动脉平滑肌细胞凋亡的作用可能与SIRT1/P53信号通路有关。亦有研究表明[14]，在急性心肌梗死模型大鼠中，心肌组织中cTnT、CK-MB、P53、Fas和Bax因子mRNA表达较高，BCL-2表达水平较低。也有研究报道称[15,16]，Bbc3在肺鳞状细胞癌、神经母细胞瘤及心肌损伤发生发展过程中扮演着重要的角色。由此可见P53、Bbc3及BCL-2可作为新型的心肌细胞凋亡预测因子。在我们的研究结果中，观察到冠脉微栓塞模型大鼠心肌细胞出现凋亡现象，结构紊乱，心肌梗死面积显著增加；给与映山红花总黄酮干预后，心肌梗死面积显著降低，该结果表明映山红花总黄酮对心肌损伤具有一定的保护作用，符合我们的预期，与既往研究报道一致[9,10]。Western blot检测结果提示，冠脉微栓塞模型大鼠心肌P53、Bbc3及BCL-2的表达水平明显增加，给与映山红花总黄酮可显著抑制组织中P53、Bbc3及BCL-2的表达水平，该结果说明冠脉微栓塞的发生发展可能与P53、Bbc3及BCL-2分子的表达改变密切相关，而映山红花总黄酮发挥心肌损伤保护作用的机制可能与抑制了心肌细胞内凋亡分子P53、Bbc3及BCL-2的水平有关。但本研究存在一定的局限性，尚未使用P53、Bbc3及BCL-2分子的特异性试剂进行下调（上调）验证，结果具有一定偶然性。并且映山红花总黄酮发挥作用的具体机制仍需进一步实验去验证。

综上所述，映山红花总黄酮对大鼠心肌损伤具有保护作用，其作用机制可能与映山红花总黄酮抑制心肌细胞内P53、Bbc3及BCL-2的表达有关。但该实验目前仅在基础实验中体现，后面仍需进一步研究的证实。