葛根素通过ERK1/2和p38 MAPK信号通路刺激成骨分化和骨形成的机制

钟海波，郭 祥，黄琳惠

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院骨科，海口 570208；2.海南省人民医院呼吸与危重症医学科，海口 570311)

葛根在我国多地均有种植，它是一种药食同源的中药，素来与人参相媲美。葛根素(puerarin，Pur)是葛根中的主要药理成分，其化学名为4, 7-二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮，分子量为416[1-2]。一些研究发现，葛根素能够刺激成骨细胞的活性或者抑制破骨细胞的功能，对预防和治疗骨质疏松症(osteoporosis，OP)有一定临床效果[3-4]。骨质疏松病理机制的一个重要方面是成骨细胞的增殖与分化受到抑制。越来越多的研究者开始探寻葛根素对骨髓间质干细胞的作用和在骨代谢过程中的角色。在骨组织中，主要功能细胞是成骨细胞，其可能来自骨膜组织、骨组织和骨髓组织。细胞的增殖和分化是生命体进化过程中的基本属性，因此细胞存在有两种状态，增殖和功能状态。MAPK(motigen activated protein kinase)信号通路是骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞定向增殖分化重要信号通路之一，其中包括ERKl/2(extracellular signal-regulated kinases 1 and 2)和p38 MAPK这两条并行且作用相反的信号通路[5-7]。p38 MAPK通路可以促进成骨细胞的分化，而ERKl/2通路却对成骨细胞的分化起到抑制作用，两条通路间的协同平衡将决定BMSCs是否向成骨细胞分化[8]。本实验通过观察葛根素对人成骨细胞增殖分化以及对ERKl/2和p38 MAPK信号通路的作用，从细胞水平探讨其刺激骨分化和骨形成的作用机制，为葛根素在临床上的进一步开发利用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

成人成骨细胞(MC3T3-E1)购自中国医学科学院细胞中心(批号：2017-2208)。

1.2 主要试剂与仪器

葛根素(HPLC>98%)购自辽宁中成药有限公司(批号：20166529)；胎牛血清，DMEM培养液、胰蛋白酶、蛋白酶E购自美国Sigma公司；ERKl/2阻断剂PD8089，p38抑制剂SB203580、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、钙测定试剂盒购自ZYMED公司；BMP-2单克隆抗体(亚诺法生技台湾总公司，货号H00000650-M06)；FITC标记亲和纯化绵羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，(Jackson公司，货号515-095-003；1∶4000)。

二氧化碳培养箱(上海美谱达有限公司)；酶标仪(上海智城有限公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

选用3～6代生长状态良好的MC3T3-E1成骨细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，以每孔1.0×104均匀接种于96孔板。用10%FCS+DMEM培养液继续培养，待细胞贴壁生长至70～85%融合时，用0.5%FCS+DMEM培养液替换原培养液，继续培养(37℃，5%CO2)，作细胞生长曲线，确定细胞生长的对数期。

1.3.2 不同浓度葛根素对成骨细胞增殖的影响

细胞培养液中分别加入浓度为0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L葛根素的等体积0.5%FCS+DMEM培养液作用，分析其对细胞增殖的影响。

1.3.3 ERKl/2和p38 MAPK信号通路对成骨细胞的影响

分4组：对照组(Control group)，T组(1 μmol/L葛根素，T group)，T+PD组(1 μmol/L葛根素+10 μmol/L ERKl/2阻断剂PD8089，T+PD group)，T+SB组(1 μmol/L葛根素+10 μmol/L p38抑制剂SB203580，T+SB group)均培养5 d，细胞接种于96孔板，每组设24孔，3次重复。

1.3.4 MTT法检测细胞增殖

待测细胞液中加入MTT溶液(5 mg/mL)每孔20 μL，继续孵育4 h，每孔再加入150 μL二甲基亚砜，室温摇床振荡10 min使其充分溶解，后在酶标仪上 49 nm处测定吸光值(OD值)。并且，根据MTT绘制细胞生长曲线：选用3～6代生长状态良好的MC3T3-E1成骨细胞，按以每孔1.0x104均匀接种于96孔板，共7板，从第一天开始，每天取出一板细胞进行MTT比色，一共检测七天。根据每组细胞的OD均值绘制成骨细胞生长曲线。

1.3.5 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测定

PBS缓冲液洗涤细胞2次，0.04 g/L蛋白酶E消化，加入底物0.09 mol/L p-磷酸硝基酚，在pH 10.3的反应液内，37℃下反应30 min，最后加入0.1 mol/L NaOH终止反应。结果以酶标仪在405 nm处测得的吸光度(OD)值表示，每组做6个重复，ALP活性单位为mmol/(L·min·g)pro。

1.3.6 钙沉积量的测定

PBS缓冲液洗涤细胞2次，每孔加入200 μL 0.6 mol/L盐酸脱钙24 h，用ZYMED公司钙测定试剂盒检测上清液中的钙浓度。钙沉积量表示为mg/g pro。

1.3.7 利用蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测细胞BMP-2表达

提取总蛋白，使用BCA蛋白浓度试剂盒对其进行蛋白定量，并使用溴酚指示剂制备SDS-PAGE电泳样品。选取5%的浓缩胶和10%的分离胶，取20 μL蛋白样品进行上样，电泳结束后，参照Marker切取目的条带和β-actin分子量所在的凝胶制成“三明治”结构，200 mA恒流90 min，将蛋白转移至PVDF膜上。使用10%的脱脂乳粉溶液对PVDF膜进行封闭2 h后，BMP-2单克隆抗体(亚诺法生技台湾总公司，货号H00000650-M06；1: 1000)4℃孵育过夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，FITC标记亲和纯化绵羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，(Jackson公司，货号515-095-003；1: 4000)室温孵育2 h，用TBST洗膜三次，使用ECL化学发光液对蛋白进行显色成像。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 成骨细胞生长曲线

如图1所示，成骨细胞生长曲线呈“S”形，第3～5天为细胞生长对数期，第5天后进入平台期。

图1 MC3T3-E1成骨细胞生长曲线Figure 1 Growth curve of the MC3T3-E1 osteoblasts

2.2 不同浓度葛根素对成骨细胞增殖的影响

加葛根素干预1天和3天后，各组的OD值与对照组无明显差异(P>0. 05)。加葛根素干预5天和7天各组均高于对照组，且1 μmol/L葛根素组的OD值高于其他组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 ERKl/2和p38 MAPK信号通路对成骨细胞增殖的影响

成骨细胞加入1 μmol/L葛根素能促进成骨细胞的增殖，T组高于对照组(P<0.01)；T+PD组细胞加入10 μmol/L ERKl/2阻断剂PD8089干预后低于T+SB组(P<0.05)；T+PD组和T+SB组的OD 490值与T组比较有所下降(均P<0.01)，但均大于对照组(均P<0.01)。

2.4 ERKl/2和p38 MAPK信号通路碱性磷酸酶(ALP)活性的影响

T组ALP活性高于对照组(P<0.001)；T+PD组ALP活性低于T组，高于对照组(P<0.01)；T+SB组ALP的表达较T组更低(P<0.01)，与对照组比较其ALP活性亦较低(P<0.01)，见图2。

2.5 ERKl/2和p38 MAPK信号通路对钙沉积量的影响

T组钙沉积量高于对照组(P<0.001)；T+PD组低于T组，高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；T+SB组钙沉积量较T组降低(P<0.01)，与对照组比较其钙沉积量亦较低(P<0.01)，见图3。

2.6 ERKl/2和p38 MAPK信号通路对细胞BMP-2表达的影响

T组BMP-2表达高于对照组(P<0.001)；T+PD组低于T组，高于对照组；T+SB组钙沉积量较T组降低(P<0.001)，与对照组BMP-2表达量相比亦降低(P<0.01)，见图4。

3 讨论

成骨细胞的增殖与分化受到抑制是骨质疏松症的主要致病机理，因其不能形成一定量的胶原性蛋白和非胶原性蛋白，降低了骨密度和骨质量，最终导致骨断裂。成骨细胞是骨代谢的主要功能细胞，其增殖和分化很大程度上决定了最终形成的骨量。

中草药葛根是豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根。大量的药理研究和临床试验表明，其主要成分葛根素能够改善心肌微循环代谢、扩张冠状血管、降低血管的阻力、降血糖、改善心肌缺血的功效[9-10]。同时，葛根素还能起到抗氧化、清除超氧阴离子和OH-，抑制H2O2引起的细胞溶血和过氧化物的生成。葛根素还能抑制HL-60细胞的增殖，从而抑制肿瘤的形成[10-12]。葛根素对成骨分化有正向的刺激作用，其通过对骨吸收的抑制和对骨形成的刺激作用于骨代谢，并且葛根素可诱导多种成骨前体细胞[13-15]。葛根素可以通过抑制骨吸收刺激骨形成来参与骨代谢[9]。本研究通过MTT检测结果发现，葛根素能够促进成骨细胞的增殖，干预第1天和第3天后，细胞增殖趋势不明显，从第5天和7天增殖趋势明显，且葛根素的浓度与细胞增殖速度密切相关。

表1 MTT检测细胞增殖结果[1og(1/trans)](n=24)Table 1 MTT detection of cell proliferation [log(1/trans)]

注：与对照组相比，*P<0.01；与T组相比，#P<0.01。图2 各组成骨细胞ALP的活性变化情况([mmol/(L·min·g)pro],n=24)Note.Compared with control group，*P<0.01.Compared with T group，#P<0.01.Figure 2 Changes in the activity of ALP in each bone cell [mmol/(L·min·g)pro]

注：与对照组相比，*P<0.01；与T组相比，#P<0.01。图3 各组钙沉积量的比较(mg/g pro,n=24)Note.Compared with control group，P<0.01.Compared with T group，#P<0.01.Figure 3 Comparison of the amount of calcium deposits in each group(mg/g)

图4 各组细胞BMP-2表达的比较(n=24)Figure 4 Comparison of the expression of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in each group of cells

骨骼是由细胞、纤维和基质所组成的一种活的组织，在一般条件下，它在不停地吸收中形成。本实验通过测定钙沉积量观察骨形成的速度。加入葛根素后成骨细胞钙沉积量和BMP-2明显上升，当ERK1/2或p38 MAPK信号通路被阻断后，钙沉积量和BMP-2均有所下降，抑制剂 SB203580阻断 p38 MAPK信号通路后则下降趋势更为明显。该结果表明，葛根素可以促进体外培养促进骨形成，特异性抑制ERK1/2和p38 MAPK通路可降低钙的吸收，p38 MAPK通路效果更为明显。

细胞碱性磷酸酶的表达是细胞分化的早期重要指标。在本研究中，利用成骨细胞碱性磷酸酶来指示成骨细胞分化程度，加入葛根素后ALP表达上升，在ERK1/2或p38 MAPK信号通路被阻断后，碱性磷酸酶的活性均有所下降，本研究表明，葛根素可以促进体外培养成骨细胞的分化，特异性抑制ERK1/2和p38 MAPK通路可阻断葛根素对ALP活性的刺激作用，在成骨细胞分化过程中有着重要的作用。

本研究进而使用ERK1/2阻断剂PD8089后，或用抑制剂 SB203580阻断 p38 MAPK信号通路后，细胞增殖、碱性磷酸酶含量以及钙沉积量均较葛根素组有所下降。该结果证明，葛根素在骨细胞周期过程中，ERK1/2和p38 MAPK信号通路起到了调控作用。这是因为ERK信号联合反应通过支架蛋白的相互作用、亚细胞定位改变、非磷酸酶抑制物和G蛋白的调控等广泛并具特异性地媒介生物学过程。ERK1/2信号通路作为丝裂原活化通路中的一种，在成骨细胞的增殖分化中有着很高的地位。p38 MAPK信号通路主要接受成骨细胞内增殖与分化的应激信号，例如各种炎症因子(TNF-α、IL-1)等，p38MAPK通路激活后可调节成骨细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达，促进成骨细胞分化，促进骨细胞成熟，从而调控骨形成。

综上所述，葛根素可以促进体外培养的成骨细胞的增殖与分化，促进骨形成。主要机制是葛根素通过激活ERK1/2和p38 MAPK通路刺激成骨细胞的细胞周期，激活碱性磷酸酶(ALP)的表达，促进钙的沉积，最终成骨细胞成熟分化致使骨形成，这可能是其防治和治疗骨质疏松症的机制。