桦褐孔菌黄酮含量测定及抗氧化研究

林雪松，李秀格，崔鑫鑫，靳 微，李 敏*

（吉林农业科技学院中药学院·吉林吉林·132101）

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，主要分布在西伯利亚、俄罗斯和远东地区、波兰、北欧、中国大、小兴安岭和长白山地区、黑龙江、日本北海道及北美北部等纬度在北纬 45°～50°的寒冷的地区[2]。又名白桦茸等，是一种生长在桦树上的药用真菌[1]。现代研究表明，桦褐孔菌中主要化学成分为三萜类、甾醇类和生物碱类化学成分[3]，具有抗癌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗真菌等多种生物活性[4～5]。迄今，有关桦褐孔菌的质量研究报道较少。本实验拟对八个产地的桦褐孔菌进行总黄酮含量测定及抗氧化研究，为桦褐孔菌质量研究提供理论基础，进一步扩大桦褐孔菌资源的开发，保证其及相应制剂的稳定性。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

桦褐孔菌样品为实地采集或由相关单位提供，样品信息如下S1-西藏林芝、S2-黑龙江黑河、S3-黑龙江牡丹江、S4-黑龙江伊春、S5-吉林长白山、S6-吉林吉林、S7-俄罗斯西伯利亚、S8-日本北海道，留样凭证存放于吉林农业科技学院药物分析实验室。

抗坏血酸 （维生素C，南京化学试剂有限公司）；DPPH （1，3-二苯基-2-三硝基苯肼）；KH2PO4；Na2HPO4；芦丁标准品（吉林生物制品检验所）；无水乙醇；甲醇；5%亚硝酸；10%硝酸铝；0.1mol/L氢氧化钠 （以上试剂均为分析级）。

CP114电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；G-08A型高速中药粉碎机 （浙江瑞安市百信药机器械厂）；TDL-40B离心机 （东旺仪器设备有限公司）；DHG-9035A型电热鼓风干燥箱（上海源长实验仪器设备厂）；恒温水浴锅 (天津市泰斯特仪器有限公司，DK-98-II）；THC型数控超声波提取器 （济宁天华超声电子仪器有限公司）；UV-2500紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）；N-1100型旋转蒸发仪（瑞士布其有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的制备

精密吸取标准芦丁对照品溶液 (200μg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 分别置于 10 mL 比色管中， 各加60%乙醇至5 mL；加5%NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置6 min后，加10%A1(NO3)3溶液 0.5mL，摇匀，再放置6min;加4%NaOH溶液4mL，摇匀放置10～20 min。在510 nm波长处，以第1管溶液做空白分别测定吸光度，以吸光度对浓度进行回归，绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.2.2 总黄酮含量测定

将桦褐孔菌烘干、粉碎，精密称取50℃干燥至恒重的桦褐孔菌粉末1g，置于三角瓶中，加入50%乙醇100mL，超声波调至 60℃条件下，超声 15～20min，过滤，收集滤液，提取两次，用50%乙醇定容，即得。

精密吸取黄酮提取液1.0mL置于10mL比色管中，按各加60%乙醇至5mL进行操作，加5%NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置 6min；再加 10%Al(NO3)3溶液 0.5mL，摇匀放置6min；加4%NaOH溶液4mL，摇匀放置10～20 min。在510nm波长处，测定吸光度。X=(A+0.0052）×10×100/(6.03×m×1000）

式中，X为样品中总黄酮含量(以芦丁计)%；A为吸光度，m为样品的质量g。

1.2.3 方法学考察

加样回收率 精密称取S1、S2两份样品，各3份，分别将对照溶液 1.0、2.0、3.0mL 置于三角瓶中，按“1.2.2”提取及测定。

精密度 精密称取S3样品5份平行样，置于三角瓶中，按“1.2.2”提取及测定。

稳定性 选择S6样品进行稳定性实验，在0、15、30、45、60 min 测定其吸光度。

1.2.4 黄酮抗氧化能力测定

羟基自由基(－OH)的测定：向试管中加入1.00mL蒸馏水，FeSO4溶液2.00mL，水杨酸-乙醇1.50mL，最后加H2O2(0.03%)0.10mL启动反应，振荡混合，在波长510nm处测定其吸光度值A0。

向试管中加入样品提取物溶液1.00mL，FeSO4溶液2.00mL，水杨酸-乙醇 1.50mL，最后加 H2O2（0.03%）0.10mL启动反应，振荡混合，水浴 37℃，保温 30min，离心（3000r，10min），在波长510nm下测量各自的吸光度值AS。

自由基清除率计算公式为：D=（A0-AS）/A0×100%。

式中，A0为空白管的吸光度，AS为加入自由基清除剂后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 总黄酮测定结果

2.1.1 标准曲线

由图1标准曲线可知，芦丁含量与吸光度呈现良好的线性关系，得到回归方程为Y=6.3x-0.0052，相关系数为r=0.9992。

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 Calibration curves of rutin

2.1.2 加样回收率考察

由表1结果可知，样品回收率为98.58%～101.30%，均值为99.98%，RSD为1.34%，表明回收率良好，方法准确度较高。

表1 加样回收率考察Table 1 Sample recovery rate

2.1.3 精密度考察

由表2结果可知，RSD为1.94%，表明该方法精密度良好。

表2 精密度考察Table 2 Precsion experiment

2.1.4 稳定性考察

由表3可知，吸光度值的RSD为1.64%，结果表明供试品在60 min内稳定。

表3 稳定性考察Table 3 Stability experiment

从回收率、精密度和稳定性可看出，本实验加样回收率、精密度及稳定性均良好，方法可行。

2.1.5 黄酮的含量测定

不同产地桦褐孔菌总黄酮含量见表4。

表4 桦褐孔菌总黄酮含量Table 4 The total flavones of Inonotus obliquus

桦褐孔菌总黄酮含量方差分析结果见表5。

表5 桦褐孔菌总黄酮含量的方差分析Table 5 Yariance analysis of the total flavones in Inonotus obliquus

由表5可知P＜0.01，故在显著性水平0.01下，不同产地桦褐孔菌中总黄酮含量存在差异显著性。

表6 桦褐孔菌总黄酮含量的多重比较Table6 Multiplecomparisonsof thetotal flavonesinInonotusobliquus

由表6可以看出，产地S5桦褐孔菌总黄酮平均含量最高，与产地S2无显著差异，显著高于产地S4，且极显著高于产地 S6、S8、S7、S1、S3；产地 S2 平均含量次高，与产地S4无显著差异，且极显著高于产地产地S6、S8、S7、S1、S3、S5；产地 S1 平均含量次低，与产地 S3 无显著差异；产地S3桦褐孔菌总黄酮平均含量最低。

2.2 抗氧化能力测定结果

表7 桦褐孔菌总黄酮对羟基自由基清除率Table 7 Radical free rate of the total flavones in Inonotus obliquus

表8 桦褐孔菌总黄酮对羟基自由基清除率的方差分析Table8 Yarianceanalysis of radical freerate of the total flavones in Inonotusobliquus

由上表可知P＜0.01，故在显著性水平0.01下，不同产地桦褐孔菌中黄酮对羟基自由基清除能力存在差异显著性。

表9 桦褐孔菌总黄酮对羟基自由基清除率多重比较Table9 Multiplecomparisons of radicalfreerate of the total flavonesin Inonotusobliquus

由表9可看出，产地S5桦褐孔菌中黄酮清除羟基自由基平均能力最好，与产地S7、S6、S4无显著差异，显著高于产地S2，且极显著高于产地S8、S1、S3；产地S7平均能力次好，与产地S6、S4、S2无显著差异，极显著高于产地S8、S1、S3；产地S1平均能力次差，与产地S3无显著差异；产地S3桦褐孔菌中黄酮清除羟基自由基平均能力最差。

3 结论

不同产地桦褐孔菌总黄酮含量测定结果表明，其含量关系为S5-吉林长白山＞S2-黑龙江黑河＞S4-黑龙江伊春＞S6-吉林吉林＞S8-日本北海道＞S7-俄罗斯西伯利亚＞S1西藏林芝＞S3-黑龙江牡丹江，各产地黄酮含量均较低，其中S5-吉林长白山桦褐孔菌中的总黄酮含量最高 (0.072μg/g)，S3-黑龙江牡丹江总黄酮含量最低(0.031μg/g)。抗氧化能力测定结果表明，S5-吉林长白山、S7-俄罗斯西伯利亚、S6-吉林吉林、S4-黑龙江伊春的总黄酮清除羟基自由基的效果均较好，无显著差异。综上所述，不同产地桦褐孔菌在总黄酮含量方面存在着差异，且总黄酮有一定的抗氧化能力，这为桦褐孔菌的开发利用提供一定的理论基础。