芪芍颗粒对乙酸诱导小鼠溃疡性结肠炎的作用研究

王晓岩 ，王丹妮 ，洪 铁 ，*

(1.吉林省中医药科学院，长春130012；2.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种临床常见的病因尚不十分明确的结肠和直肠非特异性炎症性疾病，以下腹痛、便意频繁、里急后重、粘液脓血便、肛门及直肠坠胀不适感为主要临床症状。因其病因尚不完全明确，目前尚缺乏有效的治疗方法，WHO将其列为现代难治病之一[1]。芪芍颗粒是吉林省中医科学院临床专家以传统中医药理论为指导，在长期临床实践中总结出的经验方。全方由黄芪、白芍、马齿苋、败酱草、防风等多味中药组成。主要功能为补清并举，补气健脾，清热燥湿，可使患者湿热得解，气机通畅。芪芍颗粒在多年临床治疗慢性肠炎及溃疡性结肠炎方面取得了较好的疗效。本研究探讨芪芍颗粒对乙酸诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响，为芪芍颗粒治疗溃疡性结肠炎提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

BALB/c雄性小鼠，体重为18～22g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK（辽）2015-0001。将小鼠于SPF级动物室适应性饲养一周，温度为20～25℃，湿度为60%～70%，12h明暗交替照明，给予维持饲料，自由饮水。

1.2 实验试剂

乙酸（冰醋酸）由国药集团化学试剂有限公司生产；柳氮磺吡啶肠溶片由上海福达制药有限公司生产；髓过氧化物酶（MPO）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、一氧化氮（NO）测试盒均由南京建成生物工程研究所提供；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）碧云天生物技术研究所提供；小鼠白介素1β(IL-1β)ELISA Kit、小鼠肿瘤坏死因子 α (TNF-α)ELISA KIT由武汉默沙克生物科技有限公司提供。

1.3 仪器

TU-1810紫外可见分光光度计，北京谱析通用仪器有限责任公司；S-124S电子天平，德国塞多利斯股份公司；TGL-16B离心机，上海安亭科学仪器厂；HPX-9052MBE电热恒温箱，上海博迅实业有限公司；F6/10超细匀浆机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司。LEICA020-518.500CM/LS显微镜，德国LEICA公司；OLYMPUSXOO74-1生物显微镜，日本奥林巴斯公司。

2 方法

2.1 分组及给药

取BALB/c小鼠48只，按体重随机分为6组，每组8只，分别为空白对照组、UC模型组、阳性药对照组（柳氮磺胺吡啶300 mg/kg）、芪芍颗粒大剂量组（14g/kg）、芪芍颗粒中剂量组（7g/kg）、芪芍颗粒小剂量组（3.5g/kg）。 各组每天上午（9：30~10：30）灌胃一次，给药组灌胃给予相应剂量的受试物及阳性药，空白对照组和UC模型组给予相应体积蒸馏水，连续给药7 d。

2.2 动物模型的建立

参照文献[2、3]略加改进对小鼠进行造模。造模前一天小鼠禁食不禁水24h，造模开始前轻揉小鼠腹部，刺激肛门，促进小鼠排便。乙醚吸入麻醉。轻提小鼠尾部，使其与水平面呈60°倒立，经小鼠肛门插入直径1mm聚乙烯软导管，在结肠内距肛门3.5cm处，缓慢注入5%乙酸溶液100μl，迅速拔出导管，捏紧小鼠肛门倒立2min，防止乙酸溶液漏出。造模结束后将小鼠放回笼中平躺自然苏醒，常规饲养。空白对照组小鼠以同样方法注入100μl生理盐水予以对照。

2.3 统计方法

收集数据，采用SPSS17.0软件进行分析，根据检验数据资料的正态性和方差齐性，定量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05时差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对体重的影响

与空白对照组比较，UC模型组小鼠体重明显减轻，具有显著性差异，表明利用乙酸诱导小鼠溃疡性结肠炎模型成功。与UC模型组比较，芪芍颗粒剂量组均能升高小鼠体重，结果见图1。

图1 芪芍颗粒对UC小鼠每日体重影响变化

3.2 对结肠长度、重量、肠重指数的影响

与空白对照组比较，UC模型组小鼠结肠长度及重量明显缩短，具有显著性差异，肠质量分数具有统计学差异，表明利用乙酸灌肠造模成功。与UC模型组比较，芪芍颗粒高剂量组显著增加结肠长度，结肠重量有统计学差异，结果见表1。

表1 芪芍颗粒对UC小鼠结肠长度、结肠重量、肠质量指数的影响（x±s，n=8）

3.3 结肠组织病理苏木素-伊红（H&E）染色镜下观察

图2 各组小鼠结肠HE染色情况

与空白对1照组相比，UC模型组上皮细胞破损，隐窝结构消失，粘膜及黏膜下层有大量炎症细胞浸润；与UC模型组相比，SASP组与芪芍颗粒高剂量组可恢复粘膜上皮结构，修复隐窝结构，减少中性粒细胞浸润，结果见图2。

3.4 对结肠组织中SOD活性及MPO含量的影响

与空白对照组相比，UC模型组小鼠结肠组织MPO明显升高，具有显著性差异；与UC模型组比较，芪芍颗粒高剂量组均能显著降低乙酸引起溃疡性结肠炎小鼠肠道MPO水平，具有显著性差异。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织SOD活性明显降低，具有显著性差异；与模型组比较，芪芍颗粒高剂量组均能显著提高乙酸引起溃疡性结肠炎小鼠SOD活性，具有显著性差异，结果见图3。

图3 芪芍颗粒对UC小鼠结肠组织SOD活性、MPO含量的影响。

3.5 对结肠组织NO含量的影响

与空白对照组相比，UC模型组小鼠结肠组织中NO含量明显升高，具有显著性差异；与UC模型组比较，芪芍颗粒高剂量组均能显著降低乙酸引起溃疡性结肠炎小鼠肠道NO水平，具有显著性差异，结果见图4。

图4 芪芍颗粒对UC小鼠结肠组织NO含量的影响

3.6 对结肠组织中IL-1β、TNF-α含量的影响

与空白对照组相比，UC模型组小鼠结肠组织中IL-1β、TNF-α含量明显升高，具有显著性差异；与UC模型组比较，芪芍颗粒高剂量组均能显著降低乙酸引起溃疡性结肠炎小鼠肠道IL-1β、TNF-α水平，具有显著性差异，结果见图5。

图5 芪芍颗粒对UC小鼠结肠组织 IL-1β、TNF-α含量的影响。

4 讨论

结肠长度及组织病理学改变是UC研究中衡量结肠损伤的重要指标，可评价药物对UC小鼠结肠组织炎症及损伤的治疗效果。实验结果显示，各组末次给药后，UC模型组结肠长度明显缩短，HE病理染色可观察到典型的急性炎症表现，包括大量炎症细胞聚集等；阳性药柳氮磺嘧啶组和芪芍颗粒高、中、低剂量组结肠缩短现象都有好转，且HE病理染色观察发现结肠粘膜及黏膜下层炎症有不同程度的减轻。提示芪芍颗粒对溃疡性结肠炎小鼠具有治疗作用。

髓过氧化物酶（MPO）是中性粒细胞特有的一种活力酶，MPO在中性粒细胞中可使H2O2生成某些氧化物，诱导中性粒细胞和巨噬细胞自身的致炎作用，使肠道炎症进一步加重。研究中发现芪芍颗粒能降低UC模型小鼠结肠组织中的MPO含量，减少中性粒细胞的浸润，从而改善急性溃疡性结肠炎症状。超氧化物歧化酶（SOD）是细胞内主要的防御性抗氧化酶，能够清除自由基，并可抑制自由基启动的脂质过氧化反应，从而起到保护细胞膜结构与功能的完整作用[5]。结肠炎症因子iNOS诱导产生大量的NO，是UC中一种重要的促炎因子。由单核巨噬细胞、肥大细胞等产生的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β 是目前公认的能介导UC发病的促炎细胞因子，它促使中性粒细胞进入肠道病变部位，引起一系列的病理变化导致UC的形成。

实验结果表明芪芍颗粒在减轻溃疡性结肠炎小鼠结肠炎症的同时，结肠组织中的MPO、NO、TNF-α、IL-1β含量显著降低，SOD含量显著增加，提示芪芍颗粒治疗溃疡性结肠炎可能是从下调肠粘膜促炎因子（IL-1β、TNF-α、MPO 等）的表达、抑制肠粘膜氧化应激反应的发生并减少促氧化因子（NO）及增加抗氧化因子（SOD）的活力来治疗溃疡性结肠炎。关于芪芍颗粒治疗溃疡性结肠炎的机制有待进一步深入研究。