杨桃水提物对小鼠抗炎镇痛作用研究

蒋吉锋，甘子松，黄技胜，吕慧琪，黄锁义，韦嘉琦

(1.右江民族医学院 临床医学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院 药学院，广西 百色 533000；3.右江民族医学院 广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，广西 百色 533000；4.右江民族医学院 基础医学院，广西 百色 533000)

杨桃(AverrhoacaramholaL.)又名三廉、阳桃、五棱子、五敛子等，为酢浆草五敛子属热带常绿乔木的果实。杨桃有清热解毒、生津止渴、利尿通淋的功效，适宜于风热咳嗽，咽疼牙痛，烦渴，石淋，酒毒者食用[1]，有较高的药物作用。研究显示，杨桃中含丰富的糖类、挥发油、胡萝卜素、糖类、有机酸和维生素B、C，以及黄酮类化合物等成分[2]。近年已经有很多学者对挥发油的抗炎镇痛作用进行过研究[3]，同时也有认为有机酸有抗炎、镇痛和抗痛风等综合作用[4]，更重要的是不仅国内有学者认为黄酮类化合物在抗炎镇痛上有重要效果[5]，国外也有类似报道[6]，故推测杨桃可能具有抗炎镇痛的作用，但笔者尚未查找到对杨桃抗炎镇痛作用的研究报道。另外,国内外的专家学者们以小鼠为模型进行了大量的抗炎镇痛研究，其主要致力于找寻更有效的抗炎镇痛药物，改善治疗方式，这为我们试验方法的设计提供参考依据。如华陀豆不同提取物抗炎镇痛的实验研究[7]、湿生扁蕾对小鼠抗炎镇痛作用研究[8]。但关于杨桃对小鼠抗炎镇痛等药理作用的研究尚未见报道。因此，本试验探究杨桃水提物对小鼠抗炎镇痛的作用，进一步探究杨桃潜在的药用价值。

1 材料

1.1 药品

杨桃购自广西玉林市博白县东城市场，经右江民族医学院中药学教研室周世友副主任药师鉴定为酢浆草五敛子属热带常绿乔木的果实。阳性对照药为阿司匹林片，云南白药集团股份有限公司生产，产品批号：ZKA1601。

1.2 动物

昆明种小鼠(清洁级)，足龄，体质量(20±2) g，由右江民族医学院实验动物研究中心提供，生产许可证：SCXK桂2017-0003，使用许可证：SCXK桂2017-0004。动物喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食，按性别分笼。

1.3 仪器与试剂

DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，DF-15台式连续投料粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，TWCL-T5000磁力搅拌电热套(上海标和仪器有限公司)，RE 3000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，FA1204B电子天平(上海天美天平仪器有限公司)，YLS-6B智能热板仪 (上海精密仪器仪表有限公司)，二甲苯、冰醋酸均为分析纯，由天津化工试剂厂提供。水为蒸馏水。

2 方法

2.1 杨桃水提物提取工艺

将新鲜杨桃烘干称量，粉碎成粗粉，蒸馏水浸泡6 h，置圆底烧瓶内，用KDM型调温加热套加热，挥发油提取器提取挥发油和芳香成分后，转为50℃浸煎0.5 h提取水溶性成分，纱布过滤取汁后，药渣加水再煮沸，转为 50 ℃浸煎，共煎3次。药液混合，加热浓缩定容，终浓度为1.0 g/mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,4 ℃保存备用。

2.2 小鼠分组

将90只小鼠采用完全随机设计分组法分成3组：空白对照组(Blank control group, BCG)，阿司匹林组(Aspirin group, AG)及杨桃水提物组(AverrhoacaramholaL. water extract group, AWEG)，每组30只。分别进行抗炎和镇痛系列试验共3种，每种试验各组取10只小鼠。其中杨桃水提物组分别给予杨桃水提取液灌胃，阿司匹林组给予阿司匹林(0.20 g/kg)灌胃，空白对照组给予相同体积蒸馏水灌胃，均每天1次，连续给药7 d。以备进一步用各种方法观察其抗炎、镇痛反应。

2.3 抗炎作用

2.3.1 蛋清致小鼠足跖肿胀实验

取小鼠30只，雌雄各半，采用完全随机设计分组法分为3组，每组10只。给药组灌胃给予杨桃水提物10.00 g/kg、阳性药组灌胃给予阿司匹林0.20 g/kg、空白对照组灌20 mL/kg蒸馏水。连续灌胃给予相应药物6 d，第7天每只小鼠后右足足垫皮下注射蛋清30 μL致炎，并于致炎后再灌胃给予相应药物1次，3 h后处死小鼠，剪取双后足，用分析天平精确称量，以右足的重量减去左足的重量作为足跖炎性肿胀度，计算小鼠足跖肿胀度(The weight of paw swelling, WOPS)及肿胀抑制率[9](The rate of swelling inhibited, ROSI)。

肿胀度=右后足跖质量-左后足跖质量

肿胀抑制率=(空白对照组足跖肿胀度-用药

组足跖肿胀度)/空白对照组足跖肿胀度×100%

2.3.2 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验

取小鼠30只，雌雄各半，采用完全随机设计分组法分为3组，每组10只。给药组灌胃给予杨桃水提物10.00 g/kg、阳性药组灌胃给予阿司匹林0.20 g/kg、空白对照组灌20 ml/kg蒸馏水。均每日1次,连续给药7 d。末次给药0.5 h后，用二甲苯50 μL涂于小鼠右耳廓的正反面，左耳廓作为对照，0.5 h后剪下两耳，用直径6 mm的打孔器在两耳相同部位打下耳片，精密称量，以右耳的质量减去左耳的质量作为耳廓炎性肿胀度，计算小鼠耳肿胀度(The weight of auricle tumefaction, WOAT)及肿胀抑制率[10](The rate of tumefaction inhibited, ROTI)。

肿胀度=右耳片质量-左耳片质量

肿胀抑制率=(空白对照组耳肿胀度-用药

组耳肿胀度)/空白对照组耳肿胀度×100%

2.4 镇痛作用

2.4.1 热板法测杨桃水提物镇痛作用

选用雌性小鼠，热板(55±0.5)℃，观察小鼠出现舔足的潜伏期，作为痛阈指标(Pain threshold, PT)，选择痛阈在5～20 s的小鼠30只，采用完全随机设计分组法分为3组。给药组灌胃给予杨桃水提取液10.00 g/kg，阳性药组灌胃给予阿司匹林0.20 g/kg，空白对照组灌胃20 mL/kg蒸馏水。每组给药前重复测定痛阈值，取2次痛阈平均值作为正常痛阈值，连续给药7 d，每天1次，第7天给药后，在第0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0小时测量小鼠的痛阈值，记录结果，计算各组痛阈提高百分率[11](The rate of pain threshold rise, ROPTR)。

痛阈提高百分率=(给药后痛阈值-给药

前痛阈值)/给药前痛阈值×100%

2.5 数据统计分析

3 结果

3.1 杨桃水提物对蛋清致小鼠足跖肿胀作用的影响

结果见表1，蛋清致小鼠足跖肿胀模型比较成功，空白组肿胀度均值达38.54±15.59 mg，同时杨桃水提物组与空白对照组比较，足跖肿胀度均值下降明显，肿胀抑制率达36.9%，且差异具有统计学意义(p<0.01)，表明杨桃水提物减轻蛋清致小鼠足跖炎性肿胀作用明显。而与阿司匹林组比较，阿司匹林组足跖肿胀度均值较杨桃水提物组更低，肿胀肿胀抑制率更高，达56.9%，表明该试验剂量下，杨桃水提物减轻蛋清致小鼠足跖炎性肿胀作用不如阿司匹林。

组别Group剂量d(g/kg)足跖质量(mg)The weight of hind paws左足Theleft paw右足Theright pawWOPS(mg)ROSI(%)BCG-136.34±7.73176.56±17.0938.54±15.59—AWEG10.00142.28±15.56156.20±15.52∗24.30±6.66∗36.9AG0.20133.63±11.91154.49±14.20∗16.61±8.46∗∗56.9

注：*：p<0.05， **：p<0.01，与BCG对比；

Note: *：p<0.05，**：p<0.01，compare with BCG

3.2 杨桃水提物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀作用的影响

从表2看出，二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型比较成功，空白组小鼠左右耳片差异明显，同时杨桃水提物组与空白对照组比较，耳廓肿胀度均值下降明显，肿胀抑制率达39.4%，且差异具有统计学意义(p<0.05)，表明杨桃水提物减轻蛋清致小鼠足跖炎性肿胀作用明显。而与阿司匹林组比较，两组耳廓肿胀度均值相近肿胀抑制率变化不大，表明该试验剂量下，杨桃水提物减轻蛋清致小鼠耳廓炎性肿胀作用与阿司匹林相当。

3.3 杨桃水提物对热板所致小鼠疼痛反应的影响

结果如表3所示，杨桃水提物组、阿司匹林组小鼠给药后各时段痛阈值的均值较给药前增加明显，且差异具有统计学意义(p<0.01)，表明给药后杨桃水提物、阿司匹林两组小鼠对热刺激的疼痛反应潜伏期痛阈值确实较给药前提高。而与空白对照组比较，杨桃水提物、阿司匹林两组痛阈值均值都较空白组提高，且差异具有统计学意义(p<0.05，p<0.01)，证明杨桃水提物与阿司匹林均能明显延长小鼠对热刺激的疼痛反应潜伏期痛阈值，提高痛阈值。从给药后痛阈提高百分率看，在该试验剂量下，杨桃水提物与阿司匹林延长小鼠对热刺激的疼痛反应潜伏期痛阈值，提高痛阈值的效果相当。

组别Group剂量d(g/kg)耳片质量The weight ofauricle piece(mg)左足Theleft paw右足Theright pawWOPS(mg)ROSI(%)BCG-8.90±0.6019.31±1.269.93±1.73—AWEG10.007.98±0.5613.52±2.77∗6.02±3.29#39.4AG0.208.66±0.6515.11±1.51∗6.34±1.60∗36.2

注：*：p<0.05， **：p<0.01，与BCG对比；

Note: *：p<0.05，**：p<0.01，compare with BCG

4 讨论

本试验中证明了杨桃确实具有较好的抗炎镇痛效果，为进一步研究杨桃抗炎镇痛机制提供了良好的科研基础。

炎症是人类疾病中最常见的病理过程，可以发生于机体任何器官，人类的大多数疾病都与炎症有关。红、肿、热、痛及功能改变为炎症临床上的五大基本表现。而本试验中小鼠实验模型其实就是通过免疫反应、物理性致炎因子、化学性致炎因子等的致炎作用，从而达到致痛致肿而建立的，用来验证杨桃的抗炎镇痛作用。

蛋清致小鼠足跖肿胀与二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验相似，都是在致炎因子的作用下分别致使小鼠的足跖、耳廓产生炎性肿胀，然后通过控制是否给杨桃水提物，使之与空白组和阳性组对比看其用药后炎性肿胀度的变化情况，从而验证杨桃水提物是否具有抗炎作用。而从本试验中所得数据显示杨桃水提物对蛋清所致小鼠足跖炎性肿胀和二甲苯所致小鼠耳廓炎性肿胀均具有明显的抑制作用，表明了杨桃具有良好的抗炎作用。

注:a：p<0.05,b：p<0.01，与BCG组对比，“下划线”：p<0.01，与给药前对比

Note:a：p<0.05,b：p<0.01，compare with BCG, “ungerline”:p<0.01，compare with The PT before given AWE

高热是物理性致炎因子，但是本试验中的热板法所致疼痛却主要是神经性疼痛，是热刺激小鼠的足部疼痛感觉神经末梢所致的，类似于急性锐痛。而此次我们控制给药这一变量后，采用的是观测给药前后小鼠对热刺激的疼痛反应潜伏期痛阈值的改变情况，与空白组、阳性组对比后评价杨桃水提物的镇痛作用。从本试验数据看，杨桃水提物能明显延长小鼠对热刺激的疼痛反应潜伏期痛阈值，表明杨桃具有良好的镇痛作用。特别值得注意的是空白对照组小鼠的给药后痛阈值的均值、给药后痛阈提高百分率会随着热板观测的次数增加而提高。分析其原因：其一，本次观测的指标是通过观察小鼠被从放入热板仪后，到小鼠发生舔后足行为截止的时间长短来反映小鼠对热刺激的疼痛反应潜伏期痛阈值，但是小鼠舔后足是一种动物行为，因此会受到动物情绪影响，观测次数越多，情绪越激动，舔后足行为发生越迟，导致测得痛阈提高；其二，生物对环境都具有适应性，小鼠机体对热刺激的敏感性随着观测次数的增多而下降，小鼠的足部疼痛感觉神经末梢逐渐耐受热板仪相同温度的刺激，导致舔后足行为发生延迟，痛阈提高。

综上所述，本试验只是初步证明了杨桃水提物具有抗炎镇痛作用，但是该药有效成分是什么尚不明朗，需要进一步研究。综合杨桃水提物在蛋清致小鼠足跖肿胀与二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验中的抗炎作用效果，可能与其改善局部血液循环，减少渗出，加速吸收有关。将来可以通过检测炎症局部的花生四烯酸、前列腺素、缓激肽等[12]的含量分析其抗炎作用机制；通过进行β-内啡肽、脑啡肽及强啡肽等[13]的含量分析，探寻其镇痛机制。