丹酚酸B对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响*

朱元美， 尹步金， 张 旭， 唐保露， 程宇鹏， 杨解人， 郑书国, 2, 3△

(皖南医学院 1药理学教研室, 2定量药理研究所, 3药物研发中心， 安徽 芜湖 241002)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常见的并发症之一，也是引起终末期肾功能衰竭的主要原因之一[1]。DN的主要病理特征是肾纤维化，表现为肾脏固有细胞在致纤维化因子的作用下发生表型转化并分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，同时ECM降解减少，导致肾组织ECM过度集聚，进一步促进肾小球硬化、肾脏纤维化和肾功能丧失[2]。高血糖是DN的主要诱发因素之一，长期高血糖可通过多种途径诱发肾纤维化，其中诱导肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells，GMCs)表型转化并大量分泌ECM是糖尿病引起肾纤维化的主要机制之一[3]。在长期高糖刺激下，GMCs由静息状态转变为增殖分泌表型的活化状态，α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)表达上调，ECM合成和分泌增加，导致ECM蓄积而形成肾纤维化[4]。同时ECM的堆积可挤压毛细血管，肾脏血流动力学改变，组织缺血缺氧，进一步促进肾纤维化的发展。因此，抑制GMC表型转化和ECM分泌，是防治糖尿病肾纤维化、改善糖尿病预后的有效途径之一。

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是中药丹参的主要活性成分之一，具有抗氧化和抗炎等多种药理活性[5]。前期研究表明，丹酚酸B可明显减轻糖尿病大鼠肾纤维化，但对其确切分子机制目前仍不明确。本研究采用体外培养的人肾小球系膜细胞(human glomerular mesangial cells，HGMCs)，观察丹酚酸B对高糖诱导的细胞表型转化及胶原等ECM分泌的影响，并探讨其可能机制。

材 料 和 方 法

1 材料与仪器

1.1细胞与药物 HGMCs(北京北纳创联生物技术研究院)。丹酚酸B(>98%)，上海源叶生物科技有限公司。

1.2试剂 DMEM培养基(Gibco)；CCK-8试剂盒(生物科技有限公司)；Ⅰ型胶原(collagen type I，ColⅠ)、Ⅲ型胶原(collagen type III，ColⅢ)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)和层粘连蛋白(laminin，LN)ELISA检测试剂盒(浙江惠嘉生物科技股份有限公司)；RIPA裂解液和BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL发光试剂盒(上海天能科技有限公司)；抗β-actin、α-SMA、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、Smad2、p-Smad2、p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)和p-p38 MAPK抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3主要仪器 高速冷冻离心机(Eppendorf)；Infinite 200 PRO酶标仪(TECAN)；Fluor Chem FC3 化学发光凝胶成像系统(Protein Simple)；Mini PROTEAN转膜仪和PowerPac 300型电泳仪(Bio-Rad)。

2 方法

2.1细胞培养 将HGMCs置于5% CO2、37 ℃的培养箱中，用DMEM低糖培养基(5.5 mmol/L葡萄糖)培养，待细胞生长至近融合时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代培养。

2.2ECM分泌水平检测 将处于对数生长期的HGMCs接种于96孔板(每孔1×104)，培养24 h，将细胞随机分为正常对照(control)组、高糖(high glucose，HG)组及高糖+Sal B高剂量(Sal B-high dose, Sal B-H，1×10-5mol/L)、中剂量(Sal B-middle dose, Sal B-M, 1×10-6mol/L)和低剂量(Sal B-low dose, Sal B-L, 1×10-7mol/L)组。正常对照组继续用正常糖(5.5 mmol/L)培养基培养，高糖组和高糖+Sal B各组更换为高糖(33.3 mmol/L)培养基，高糖+Sal B各组同时加入相应浓度的丹酚酸B，孵育72 h。收集细胞培养上清液，按试剂盒说明测定ColⅠ、Col Ⅲ、FN和LN的水平。

2.3Western blot检测 将HGMCs接种于6孔培养板(每孔1×106)，细胞分组及处理同2.2项。收集细胞后RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)冰浴裂解2 h，12 000×g、4 ℃离心15 min，取上清液BCA法测蛋白浓度。加上样缓冲液混匀，煮沸5 min。SDS-PAGE分离蛋白、转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入抗β-actin、α-SMA、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、p38 MAPK和p-p38 MAPK抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的 II 抗，室温孵育2 h，滴加ECL发光液显色，凝胶图像分析系统拍照并分析条带光密度，结果以α-SMA/β-actin、TGF-β1/β-actin、p-Smad2/Smad2和p-p38 MAPK/p38 MAPK表示。

3 统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较应用单因素方差分析和SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 丹酚酸B对高糖诱导HGMCs表型转化的影响

HGMCs在高糖环境下孵育72 h后，α-SMA的表达水平明显增加(P<0.01)，说明HGMCs在高糖作用下发生了表型转化，向肌成纤维细胞分化;与丹酚酸B孵育可显著降低HGMCs中α-SMA表达水平(P<0.05或P<0.01)，见图1，提示丹酚酸B可明显抑制HGMCs向肌成纤维细胞分化。

2 丹酚酸B对高糖诱导HGMCs ECM分泌的影响

由表1可见，暴露于高糖环境72 h后，I型胶原、III型胶原、层粘连蛋白及纤维连接蛋白等细胞外基质的分泌量明显增加(P<0.01)，而与丹酚酸B共同孵育可显著降低细胞外基质分泌水平(P<0.05或P<0.01)。这一结果提示高糖诱导HGMCs分泌胶原蛋白等细胞外基质的能力增强，而丹酚酸B可减少高糖诱导的细胞外基质分泌。

Figure 1.The effect of Sal B on the protein levels of α-SMA in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

图1丹酚酸B对人肾小球系膜细胞α-SMA蛋白表达的影响

表1 丹酚酸B对高糖诱导HGMCs分泌ECM的影响

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

3 丹酚酸B对高糖诱导的TGF-β1蛋白表达的影响

正常培养条件下，HGMCs表达TGF-β1蛋白极少，而在高糖环境下培养72 h后，TGF-β1蛋白表达量显著增加(P<0.01);与丹酚酸B共同孵育可明显抑制高糖诱导的TGF-β1蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)，见图2。这一结果与丹酚酸B抑制高糖诱导α-SMA蛋白表达的作用一致。

4 丹酚酸B对高糖诱导Smad2磷酸化的影响

暴露于高糖环境72 h后，HGMCs内Smad2的磷酸化水平显著升高(P<0.01)，这一结果与高糖诱导TGF-β1水平升高的效应一致，提示高糖明显诱导TGF-β1/Smad信号通路激活;与丹酚酸B共同孵育可使Smad2磷酸化水平明显下降(P<0.01)，这一结果与丹酚酸B减少HGMCs细胞外基质分泌作用一致，提示丹酚酸B减少HGMCs细胞外基质分泌与抑制TGF-β1/Smad信号通路激活有关,见图3。

Figure 2.The effect of Sal B on the protein levels of TGF-β1in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

图2丹酚酸B对人肾小球系膜细胞TGF-β1蛋白表达的影响

Figure 3.The effect of Sal B on the phosphorylation of Smad2 in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

图3丹酚酸B对人肾小球系膜细胞Smad2蛋白磷酸化的影响

5 丹酚酸B对高糖诱导的p38 MAPK活化的影响

正常培养的HGMCs内p38 MAPK磷酸化水平较低，而暴露于高糖环境72 h后，p38 MAPK磷酸化水平显著升高(P<0.01)，提示高糖明显诱导了p38 MAPK活化;在丹酚酸B存在的情况下，高糖诱导的p38 MAPK磷酸化水平明显下降(P<0.05或P<0.01)，见图4，提示丹酚酸B可有效抑制高糖诱导的p38 MAPK活化。

Figure 4.The effect of Sal B on the phosphorylation of p38 MAPK in the HGMCs. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

图4丹酚酸B对人肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化的影响

讨 论

DN是糖尿病最主要致死原因之一，其主要病理特征是肾脏固有细胞在各种有害因子刺激下发生表型转分化并分泌大量细胞外基质引起的肾纤维化。高血糖是糖尿病肾病主要危险因素之一，可明显加速糖尿病肾病的进展，而良好的血糖控制则可有效延缓其发生发展[6]。然而，由于健康教育、医疗服务和患者治疗依从性等多方面因素的影响，目前我国糖尿病患者血糖达标率仍处于较低水平[7]。因此，寻找有效措施防治糖尿病肾纤维化就成为减少糖尿病肾病、改善糖尿病预后的有效途径之一。

肾小球系膜细胞是肾脏固有细胞之一，位于肾小球毛细血管袢之间，具有维持肾小球毛细血管网结构完整性、调节肾小球滤过率及分泌多种细胞因子如TGF-β1等生物学功能。在高糖等因素作用下，肾小球系膜细胞可大量增殖并发生表型转化，合成并分泌大量ECM，引起肾纤维化[4]。α-SMA是肾小球系膜细胞发生表型转化的标志性蛋白之一，也是GMCs受损激活和发生表型转化的重要标志，在多种原因诱导的纤维化肾组织中，α-SMA表达水平明显升高[8]。本研究结果显示，在高糖环境下培养72 h后，HGMCs表达α-SMA蛋白的水平明显升高，同时ColⅠ、ColⅢ、FN和LN等ECM成分分泌也显著增加，说明高糖诱导肾小球系膜细胞向肌成纤维细胞分化并分泌大量ECM成分。与丹酚酸B共同孵育可显著减少高糖诱导的α-SMA表达和ECM分泌，这一结果与丹酚酸B抑制糖尿病大鼠肾纤维化作用一致，提示丹酚酸B改善糖尿病肾纤维化与抑制肾小球系膜细胞表型转化并分泌ECM有关。

TGF-β1是TGF-β超家族一员，广泛参与组织纤维化、炎症等多种病理生理过程，其中TGF-β1/Smad信号通路的异常激活是糖尿病肾纤维化的主要机制之一[9]。当TGF-β1与其受体结合后，受体的激酶活性被激活，后者可使Smad2蛋白发生磷酸化。活化的Smad2蛋白可与Smad4形成复合物进入胞核，启动I、III型胶原等ECM成分基因转录，诱导纤维化形成。本研究显示，正常培养条件下，HGMCs仅表达少量的TGF-β1，细胞内Smad2蛋白磷酸化水平也较低。在高糖环境下培养72 h后，TGF-β1表达和Smad2蛋白磷酸化水平均明显升高，说明高糖明显诱导了TGF-β1/Smad信号通路激活。与丹酚酸B共同孵育可有效抑制高糖诱导的TGF-β1蛋白表达和Smad2蛋白磷酸化，提示丹酚酸B减少HGMCs细胞外基质分泌与抑制TGF-β1/Smad信号通路激活有关。大量研究显示，TGF-β1一方面可通过激活Smad信号通路促进细胞分泌ECM成分，另一方面还可通过多种信号途径诱导细胞表型转化。一旦肾脏固有细胞转分化为肌成纤维细胞，其合成和分泌ECM成分及TGF-β1的能力将进一步增加，形成恶性循环[10]。本研究显示丹酚酸B可有效抑制高糖诱导的HGMC表型转化及ECM分泌，并使TGF-β1分泌减少，提示丹酚酸B可能有助于抑制糖尿病肾病肾纤维化的发生发展。

此外，p38 MAPK在糖尿病肾病肾纤维化中也发挥重要作用[11-12]。TGF-β1可通过p38 MAPK信号通路诱导肾小球系膜细胞分泌细胞外基质，促进肾纤维化[13]。在糖尿病肾病患者肾组织中，p38 MAPK磷酸化水平显著增加，抑制p38 MAPK活化可明显减轻肾纤维化水平[14]。高糖培养的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞p38 MAPK活化水平也明显升高，而抑制p38 MAPK活化可明显减少胶原等细胞外基质的分泌[15-16]。本研究显示，高糖条件下培养的HGMCs内p38 MAPK活化水平显著升高，而丹酚酸B可明显下调其活化水平，提示抑制p38 MAPK活化可能也是丹酚酸B抑制HGMCs分泌ECM的机制之一。

综上所述，丹酚酸B可明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化，减少ECM成分合成与分泌，其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路及p38 MAPK活化有关。