蜗牛药材质量标准提升研究

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1.内蒙古蒙医药工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000

蜗牛为巴蜗牛科动物同型巴蜗牛BradybaenasimiLarisFerussac 的贝壳。夏、秋二季捕捉，置沸水中略煮，去肉，洗净，晒干。蜗牛，蒙古文名音译“布热-好日海”[ 1]，别名音译“东日阿”。《无误蒙药鉴》记：“‘东日阿’…《晶鬘》中云：‘从状如盾、扁而旋绕的壳中出，硬壳驮于背后。尿液中炮制用。” 《医典》中云：‘蜗牛杀虫，利水肿’”[2]。蒙古文别名“东日阿”意译为像似海螺，系前人依据动物形状命名。性咸、凉，味甘。具有消水肿，利尿，杀虫，清瘟疫功效。用于水肿，肾热，膀胱热，尿闭，尿路结石，协日疫，黄水疮，肠寄生虫。本品1986年载入《内蒙古蒙药材标准》[ 1]，该标准仅就其【性状】做了规定外，缺少其它有效的质量控制方法及指标。通过实验研究，为蜗牛建立稳定、可靠、准确的检查、含量测定方法，填补该药材质量标准项下空白项。合理控制质量，保证其用药安全及疗效提供可靠的依据。

1 实验材料

1.1 药材 蜗牛来源：X1(批号：160626，河北安国)；X2(批号：20161106，山东)；X3(批号：170101，广西)；X4(批号：170102，安徽)；X5(批号：20170208，山东)；X6(批号：20170307，河北保定)； X7(批号：20170219，湖南)，经鉴定为同型巴蜗BradybaenasimiLarisFerussac 的贝壳。见图1。

1.2 仪器 滴定管(50 mL)，磁力搅拌器，BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，T-1200N型马弗炉(郑州天纵)，DL-1型电炉(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.3 试药 乙二胺四醋酸二钠；碳酸钙；盐酸；氢氧化钾；氨溶液；氯化铵以上均为分析纯；基准氧化锌；甲基红；钙黄绿素；铬黑T。

2 方法与结果

2.1 鉴别 本品属动物壳类药材，主含碳酸钙。故照 《中国药典》 2015年版四部(通则0301)[ 3]相关方法对其进行了一般鉴别试验。

2.1.1 钙盐鉴别 取铂丝用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰即显砖红色。结果见图 2，7批药材钙盐的火焰鉴别反应，均呈阳性。

2.1.2 沉淀鉴别 取本品粉末0.5 g，加稀盐酸5 mL，即产生大量气泡，滤过，滤液加甲基红指示液2滴，用氨试液中和，再滴加盐酸至恰呈酸性，加草酸铵试液，即生成白色沉淀；分离，沉淀不溶于醋酸，但可溶于稀盐酸。结果见图3～7。7批药材钙盐的沉淀鉴别反应，均呈阳性。

2.1.3 碳酸盐鉴别 取本品粉末0.5 g，加稀盐酸5 mL即泡沸，产生二氧化碳气体，导入氢氧化钙试液5 mL中，即生成白色沉淀。结果见图8，7批药材的碳酸盐鉴别反应，均呈阳性。

2.2 灰分检查 照《中国药典》2015年版四部(通则2302)[ 3 ]灰分测定法，对7批样品的总灰分及酸不溶性灰分进行了考察测定。

2.2.1 总灰分测定取供试品2 g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量(精准至0.01 g)，缓缓炽热，至完全碳化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品总灰分的含量(%)。结果见表3。本品含碳酸钙达90%以上，此炽灼条件下不分解，故测定结果减失重量均较少。该项检查不收入标准草案正文。

2.2.2 酸不溶性灰分测定 取上项所得的灰分，在坩埚中小心加入稀盐酸约20 mL、用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用热水5 mL冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移同一坩埚中，干燥，炽灼至恒重。根据残渣重量，计算供试品酸不溶性灰分的含量(%)。注意避免燃烧。结果见表1。本品壳内易聚集泥沙，影响药材质量，故应控制其酸不溶性灰分。蜗牛酸不溶性灰分测定结果表明，7批样品中酸不溶性灰分平均值为7.51%，6批样品酸不溶性灰分均低于9.0%，测定值中仅有一例大于9.0%，故本品酸不溶性灰分不得过9.0%。

表1 蜗牛总灰分及酸不溶性灰分的测定结果 (%)

2.3 重金属 照重金属检查法《中国药典》2015年版四部(通则0821第一法)[ 3 ]对本品进行了检查。

2.3.1 标准铅溶液的制备 称取硝酸铅0.1599 g，置1000 mL量瓶中，加硝酸5 mL与水50 mL溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取贮备液10 mL，置100 mL量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL相当于10 μg的Pb)。本液现用现配。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品0.50 g，2份，分别置25 mL纳氏比色管中，一份(乙管)加水5 mL，混合均匀，加稀盐酸4 mL，煮沸5 min，放冷，滤过，滤器用少量水洗涤，合并洗液与滤液,加酚酞指示液1滴，并滴加适量的氨试液至溶液显淡红色，加稀醋酸2 mL与水制成25 mL，加维生素C 0.5 g，溶解后既得；另一份(丙管)加水5 mL，混合均匀，加稀盐酸4 mL，煮沸5 min，放冷，滤过，滤器用少量水洗涤，合并洗液与滤液,加酚酞指示液1滴，并滴加适量的氨试液至溶液显淡红色，加稀醋酸2 mL，标准铅溶液2.00 mL(20 ug)与醋酸盐缓冲液(pH3.5)2 mL后，加水制成25 mL，加维生素C 0.5 g，溶解后既得。

2.3.3 检查方法 取25 mL纳氏比色管一支(甲管)，加标准铅溶液2 mL与醋酸盐缓冲液(pH3.5)2 mL后，加水稀释成25 mL，加维生素C 0.5 g。作为对照品溶液。取甲管对照品溶液与供试品溶液乙管，丙管，分别加硫代乙酰胺试液各2 mL，摇匀，放置2 min，照《中国药典》2015年版四部(通则0821第一法)[ 4]依法操作，比较检查，结果见表2。7批供试品溶液的颜色都浅于10 μg标准铅溶液的颜色，重金属含量均少于百万分之二十。本品重金属含量不过20 mg/kg。

表2 蜗牛重金属检查结果

2.4 含量测定

2.4.1 滴定液的制备 取乙二胺四醋酸二钠19 g，加适量的水使溶解成1000 mL，摇匀。取于约800℃灼烧至恒重的基准氧化锌0.1220 g，精密称定，加稀盐酸3 mL使溶解，加水25 mL，加0. 025%甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25 mL与氨-氯化铵缓冲液(pH 10.0 )10 mL，再加铬黑T指示剂少量，用本液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正(空白消耗量为0.05 mL)。 每1 mL乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 moL/L )相当于4. 069 mg的氧化锌。根据本液的消耗量与氧化锌的取用量，算出本液的浓度，即得。本试验用乙二胺四醋酸二钠滴定液的浓度为0.0501 moL/L。其校正因子F为1.002。

2.4.2 测定方法 取本品细粉约0.15 g，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸10 mL，加热使溶解，加水20 mL与甲基红指示液1滴，滴加10%氢氧化钾溶液至溶液显黄色，继续多加10 mL，加钙黄绿素指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 moL/L)滴定至溶液黄绿色荧光消失而显橙色。每1 mL乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 moL/L)相当于5.004 mg的碳酸钙(CaCO3)。

2.4.3 线性与范围 取碳酸钙0.100 g、0.125 g、0.150 g、0.175 g、0.200 g，精密称定，分别置锥形瓶中，照“2.4.2测定方法”项下方法，自“加稀盐酸10 mL”起依法操作，以样品量(x)对乙二胺四醋酸二钠滴定液(EDTA 0.05 moL/L)的消耗体积(y)进行线性回归，得标准曲线回归方程为：y=197.53x+0.4664，相关系数r=0.9999。表明碳酸钙的取样量在0.1～0.2 g范围内，与乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 moL/L)的消耗体积具有良好的线性关系。

2.4.4 精密度试验 取碳酸钙0.15 g，精密称定，置锥形瓶中，照“2.4.2测定方法”项下方法，自“加稀盐酸10 mL”起依法操作，连续测定6次，并计算含碳酸钙测得率。碳酸钙的测得率为100.92%，RSD为0.18%。结果表明该试验精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 精密称取样品X4(批号170102)0.15 g，照“2.4.2测定方法” 分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时间段依法测定，其结果平均含量为91.36%、RSD为0.21%。表明该方法稳定性良好。

2.4.6 重复性试验 称取样品X4(安徽，批号170102)0.15 g，6份，精密称定，分别照“2.4.2测定方法”依法测定，其结果重复性良好，平均含量为92.22%、RSD为0.16%。

2.4.7 回收率试验 取已知含量的样品X4(安徽，批号170102)0.075 g，9份，精密称定，各置锥形瓶中，分三组按标准品加入量-样品中含量0.5∶1、1∶1、1.5∶1的要求分别依次精密加入碳酸钙，照“2.4.2测定方法”项下方法，自“加稀盐酸10 mL”起依法操作，平行测定3次，其CaCO3的总平均回收率为100.51%、RSD为0.20%。结果见表3。

表3 回收率试验结果

2.4.8 样品测定 取蜗牛样品细粉0.15 g，精密称定，各置锥形瓶中，照“2.4.2测定方法”，自“加稀盐酸10 mL”起依法操作，测定并计算含量。蜗牛平均含量为92.07%，RSD为0.31%。结果见表4。

表4 蜗牛及制蜗牛样品测定结果

样品批号n蜗牛含量 /%平均值 /%RSD/%692.5292.680.14X7190.85湖南291.0220170219391.20491.06591.60691.4491.190.31平均含量92.070.31

3 讨论

蜗牛主含碳酸钙，所以参照《中国药典》2015年版一部载石决明【含量测定】项下方法，研究建立了采用乙二胺四醋酸二钠配位滴定法对其碳酸钙(CaCO3)含量进行测定的方法。

蜗牛7批样品碳酸钙的平均含量约为92.07%，其含量范围为91.69%～92.45%，各批间含量较接近(RSD=0.31%)。故取其下限，暂定蜗牛含碳酸钙(CaCO3)不得少于90.0%。

制蜗牛7批样品碳酸钙的平均含量约为95.44%，其含量范围为95.04%～95.84%。各批间含量较接近(RSD=0.40%)。故取其下限，暂定制蜗牛含碳酸钙(CaCO3)不得少于94.0%。