新疆某牛场牛结核病的综合诊断与病原分离鉴定

林 康，田莉莉，常塔娜，温建新，范伟兴

牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)所引起的一种慢性消耗性的传染病，可经呼吸道、消化道进行传播，具体病理表现为组织器官形成明显的结核结节，继而结节中心出现干酪样坏死或钙化。牛结核病以肺结核多见，近年来，也有对肺外结核的研究报道[1]。由于结核病在世界各地均有发生，是较为严重的人兽共患病。除了会影响人畜的健康外，还能够引起产量下降和贸易限制从而产生经济影响[2]，OIE将其列入法定报告疫病，我国将其列为二类动物疫病。

牛结核病检测的方法有很多，如皮内变态反应、比较变态反应、牛型PPD点眼试验、IFN-γ试验、ELISA抗体检测试验、病原的分离培养及PCR等方法[3]。目前官方公布的牛结核病的清除方法主要是基于检疫和屠宰政策[4]，采用基于细胞介导的免疫反应的诊断试验，如皮内变态反应试验和INF-γ试验[5]。我国以结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验及IFN-γ试验作为牛结核病检测的标准。传统的分离培养因结核分枝杆菌生长缓慢，耗费时间，不能满足临床诊断的需要。而以PPD皮内变态反应试验为标准在检测牛结核病时，由于其灵敏度高、特异性低，容易因为非致病性的分枝杆菌如禽分枝杆菌及环境中的其他分枝杆菌造成假阳性的现象，影响判定结果。依靠单一诊断方法锁定的阳性牛在剖检时常常找不到病变部位，为后续的采样分菌工作带来困难。因此，在牛结核病的诊断过程中多种检测方法的组合使用有助于牛结核病的确诊。

本试验选择新疆牛结核病历史高发，且在以往的诊断过程中存在禽分枝杆菌干扰的某牛场，为锁定阳性牛，找到病变进行分菌，综合运用皮内变态反应、牛型PPD 点眼试验、IFN-γ试验、ELISA抗体检测试验4种免疫学方法进行了牛结核病的诊断。锁定阳性牛后，对其扑杀、剖检，采集病料后进行病原的分离鉴定。

1 材料与方法

1.1材料 牛型 PPD、禽型 PPD、BOVIGAM牛分枝杆菌γ-干扰素ELISA检测试剂盒、IDEXX牛分枝杆菌抗体检测试剂盒、罗氏培养基。

1.2 检测方法

1.2.1皮内变态反应 按照国家标准进行操作和判断。

1.2.2牛型PPD点眼反应 进行点眼前，认真检查待检奶牛的双眼，眼观不正常的不进行点眼检测。将2～3滴牛型PPD滴入左眼。点眼后，分别在3 h、6 h、9 h各观察1次反应情况，必要时可在24 h后观察点眼反应。若观察到黄白色脓性分泌物，判定为阳性牛。

1.2.3IFN-γ试验 采集5 mL检测牛的抗凝全血，分别用特殊制备的牛型 PPD、禽型 PPD及PBS 3种刺激抗原对全血进行24 h的体外刺激。24 h后，收集刺激上清，按试剂盒说明书进行IFN-γ检测。若牛型 PPD 的 OD 值-阴性抗原(PBS)的 OD 值≥0.1 且牛型 PPD 的 OD 值-禽型 PPD 的OD值≥0.1，判定为阳性牛。

1.2.4ELISA抗体检测 采集检测牛的全血，静置离心后收集血清，按试剂盒说明书进行ELISA检测。其中S/P=(样品OD值-阴性OD平均值)/(阳性 OD 平均值-阴性 OD 平均值)，若S/P≥0.3，判定为阳性牛。

1.3剖检与病料采集 将4种方法均判定为阳性的牛进剖检，检查病变组织，无菌采集病变组织置于样品杯中。

1.4病原分离培养 分离培养前在生物安全柜中将待处理组织进行解冻，去除多余脂肪后，切碎组织，制成匀浆液。用巴氏吸管吸取适量的接种液，均匀接种在整个培养基斜面上。将培养基置于37 ℃温箱中进行培养。接种后每过一周观察菌落生长情况，8周后未生长的为阴性。

1.5PCR鉴定 提取核酸，用已建立的PCR方法对分离菌株进行结核杆菌群内的鉴定。

1.5.1引物的合成 根据文献[6]中的报道，由生工合成7对引物，如表1所示。

表1 结核分枝杆菌复合群内PCR引物
Tab.1 PCR primers of MTC

PrimersPrimers sequences(5′-3′)Products length/bp16sRNAF:ACGGTGGGTACTAGGTGTGGG-TTTC543R:TCTGCGATTACTAGCGACTCC-GACTTCARv0577F:ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAG-GCAA786R:CTATTGCTGCGGTGCGGGCTT-CAAIS1561F:GCTGGGTGGGCCCTGGAATAC-GT-GAACTC943R:AACTGCTCACCCTGGCCACCA-CCATTGACTRv1510F:GTGCGCTCCACCCAAATAGTTGC1033R:TGTCGACCTGGGGCACAAATC-AGTCRv1970F:GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC1116R:CGCCGGCAGCCTCACGAAATGRv3877/8F:CGACGGGTCTGACGGCCAAAC-TCATC999R:CTTGCTCGGTGGCCGGTTTTT-CAGCRv3120F:GTCGGCGATAGACCATGAGTC-CGTCTCCAT404R:GCGAAAAGTGGGCGGATGCCA-GAATAGT

1.5.2反应体系与扩增程序 反应体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物各1 μL，模版DNA 1 μL，ddH2O 7 μL，反应的总体积为20 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 1 min变性，64 ℃ 1 min退火，72 ℃ 1 min延伸，循环30 次；72 ℃ 10 min延伸。结束后置于4 ℃保存。

1.5.3结果判定 取5 μL 的PCR产物于1.0 %琼脂糖凝胶中电泳后在凝胶成像仪中观察结果，条带根据文献[6]按照表2进行结果判断。

表2 结核分枝杆菌群内PCR方法的判定标准
Tab.2 Criteria for PCR in mycobacterium tuberculosis

Organism16sRNARv0577IS1561Rv1510Rv1970Rv3877/8Rv3120M. tuberculosis+++++++M. africanum subtype I++++-++M. africanum subtype II +++++++“M. canettii”++++++-M. caprae++++-+-M. bovis +++--+-M. bovis BCG+++----M. microti++-+-++MOTT +------

Note：+shows that it can amplifie the target fragmentit;-shows that it cannot.

2 结 果

2.14种方法综合检测结果 该牛场为结核病隔离场，755头牛均为皮试阳性，将点眼、INF-γ试验和ELISA抗体检测结果均为阳性的牛判定为阳性病变牛，共26头，如表3所示。

表3 4种检测方法结果
Tab.3 Results of the four detection methods

Detection4 detection methodsSICTEye-drops reactionINF-γ test ELISA detectionPositivesAutopsy755755(100%)44(5.8%)352(46.6%)211(27.9%)26(3.4%)5

2.2病原分离鉴定结果 从26头阳性牛中根据年龄，泌乳状况等实际生产状况从中随机选择5头牛进行剖检。剖检的5头牛进行编号，分别为03、08、47、94、97，剖检后均在肺部发现明显的结节病变，病变情况见表4。5头牛的病料培养结果均为阳性。对阳性菌进行PCR鉴定，从左至右依次对应的引物16sRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8、Rv3120。根据判断标准，结果均为牛分枝杆菌(图1)。

M：100 bp DNA maker；1-7，8-14：Isolated strain(All others identical)图1 MTC群内PCR鉴定结果Fig.1 PCR results of MTC

表4 病变结果
Tab.4 Results of lesions

No.Diseased regionLesion status03lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material08lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material47lungLesion,with nodules94lungLesion,with nodules97lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material

3 讨 论

近年来，我国在牛结核病检疫中以皮内变态反应试验及IFN-γ试验作为标准判定的结核阳性牛剖检普遍出现在肺脏无法找到结核病变的情况，这可能因为其它非致病性的分枝杆菌如禽分枝杆菌及环境中的其他分枝杆菌造成假阳性的结果[7]，也可能是因为上述两种方法均为牛结核病早期诊断方法，被扑杀的大部分牛仍处于感染早期尚未产生肉眼可见病变的阶段[8]。所以本试验使用皮内变态反应、牛型PPD 点眼试验、IFN-γ试验，ELISA抗体检测4种免疫学诊断方法的组合，对新疆某奶牛场进行了牛结核病诊断，找到阳性病变牛。其中皮内变态反应、IFN-γ试验是针对牛结核早期感染，而PPD点眼和ELISA抗体试验是针对牛结核后期感染。在IFN-γ试验中，755头奶牛中有46.6%的阳性率，ELISA抗体检测中有27.9%的阳性率，4种方法诊断结果均为阳性的牛共26头。因条件局限，从中随机选择5头牛进行剖检，均能够发现明显的结核病变。以此推测，其余21头牛剖检后能够发现肉眼可见的结核病变。剖检结果证明，多种诊断方法的组合使用能提高牛结核病的诊断的准确性，检出有病变的牛。

从26头牛中剖检的5头牛主要表现为肺结核，在肺部均有明显结节病变。其中47，94两头牛有结节病变，其余03，08，97三头牛切开结节病变后有大量的干酪样物质，已处于结核后期感染阶段。每头牛挑选具有典型病变的病料进行分菌，4周后观察培养基表面出现黄色或白色的菌落。5份病料均分离到细菌，分菌率为100%(5/5)。

将5株菌用多重PCR的方法进行分型鉴定，扩增片段大小依次为 543 bp、786 bp、943 bp、999 bp，依据条带大小和判断标准，5株菌都为牛分枝杆菌。在4种方法组合的基础上进一步确定锁定的阳性牛为牛分枝杆菌感染。在分离到菌后，可用于牛分枝杆菌的鉴定，将其与临床上其他重要的非致病性结核分枝杆菌分开来。

临床诊断时，上述4种诊断方法耗时较长。如比较变态反应需3 d后观察结果，IFN-γ试验需要24 h的孵育时间，在临床诊断中急需建立一种操作简便，快速高效的诊断方法。已有研究证明牛分枝杆菌存在于感染动物的粪便及污染牛场的土壤和饮水中[9]，相较于普通PCR需要分离出病原菌，建立一种能快速有效的检测奶样，粪便或环境样品的荧光定量PCR方法可以大幅度的节约时间，具有很高的实用价值，这也是未来牛结核病诊断方法研究的方向之一。

利益冲突：无