不同来源的间充质干细胞治疗骨性关节炎的研究进展

吴 琪，曹文东，何超鹏综述，陈 铖审校

0 引 言

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，其发生发展是长期、慢性、渐进的病理过程，其发病机制复杂，目前尚未彻底阐明，其典型特征是软骨退变，包括软骨降解、关节滑膜纤维化、关节局部炎症、软骨下骨硬化、骨髓病变、骨赘形成等一系列的退行性病变，最终引起关节疼痛、僵硬、失用等行为功能障碍［1-2］。据国外流行病学统计OA 患病率在50 岁到60 岁的人群中已达50%，75 岁以上的老年人患病率高达80%，且随年龄增长OA 呈进行性发展，晚期致残率可高达53%，严重影响中老年人群的身体健康和生活质量［3］。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类从多种组织器官中胚层和外胚层分离培养的具有干细胞特征的多能成体干细胞，是干细胞家族重要的一类细胞类型，是最具代表性的成体干细胞，具有来源广、多向分化能力、可塑性强、免疫原性低、可旁分泌多种生物活性因子和致畸致瘤风险低等优良生物学特点，在OA 和软骨缺损的治疗中具有重要意义［4］。目前MSCs对OA的治疗作用可通过以下三种途径实现：①分化为软骨细胞，修复受损的软骨组织；②分泌抗炎因子和营养因子促进软骨前体化和去分化等来抑制软骨组织破坏，减轻软骨受损；③分泌抗炎因子，抑制关节腔内巨噬细胞活性，降低炎症因子释放，从而抑制OA［5］。随着软骨组织工程的发展给OA 患者带来了希望，利用组织工程技术修复磨损退化的软骨研究及临床应用取得较大的突破。近年来MSCs 治疗OA 飞速发展，本文就目前不同来源的MSCs 基础实验及临床应用在OA中的研究进展作一综述。

1 可用于治疗OA 的MSCs 种子细胞及其优劣分析

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）是最早被人类发现的干细胞，来源于发育旱期的中胚层和外胚层，在组织工程中的实验研究及临床应用中十分广泛，BM-MSCs 主要部位为髂嵴、胫骨或股骨，可通过骨钻孔抽吸骨髓采集。从骨髓中分离的MSCs 具有易分离、易增殖和高分化潜能等优势，因此被众多研究者认为是组织工程最理想的种子细胞，已广泛应用于临床，尽管如此，来自OA患者的BM-MSC不是软骨组织修复策略的最佳来源，随年龄增长，BM-MSCs 数量较少、增殖分化程度降低、病毒感染率增高，这种逆向关系使干细胞疗法难以应用于老年患者［6］。脂肪间充质干细胞（human adipose-derive mesenchymal stem cells，AD-MSCs）是从脂肪组织经过分离体外培养而成的具有多向分化潜能和自我更新的干细胞，脂肪组织来自于胚胎发育期间的中胚层并且广泛存在于各种哺乳动物的全身各部位，AD-MSCs 的细胞表型与BM-MSCs 非常相似，一般通过脂肪抽吸术，该种方式对人体侵入性小，提取量多。其主要优点在于组织来源丰富、易获取，在向软骨分化的培养中ADSCs 增殖更快，更能耐受缺血、缺氧的关节软骨微环境引起的凋亡［7］。脐带血间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells，UCBMSCs）和脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，可从废弃脐带或脐带血库中获得，能成功分化为包括软骨细胞在内的多种组织细胞，这种组织来源的MSCs 不仅保持了固有生物学特性，还表达出多种胚胎干细胞特有表面分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强免疫原性弱、取材方便、无道德伦理问题限制、易于工业化制备等优势［8］。滑膜间充质干细胞（synovial mesenchymal stem cells，S-MSCs）通过关节镜获取，滑膜组织除可在健康人体内获取外，OA 或类风湿关节炎患者也可成为其来源，滑膜组织含量丰富且可再生，S-MSCs在体外传至十代以上仍保持良好的生长状态，属稳定传代的细胞系，且向软骨分化方面极具潜力。在未来有可能成为软骨修复领域的种子细胞［9］。Jones 等［10］报道了在OA 患者的关节液中发现了MSCs 的存在，之后又进一步研究，得出了早期膝关节OA 的关节液间充质干细胞（synovial Fluid derived mesenchymal stem cells，SF-MSCs）将会增多的结论［11］。黄秋生等［12］认为成人鼻腔呼吸部黏膜固有层内广泛存在MSCs，该细胞可在体外培养和扩增，并保持其干细胞特性和多向分化潜能，并称之为鼻黏膜间充质干细胞（nasal murine mesenchymal stem cells，NM-MSCs）。其中倍受人们关注的嗅黏膜干细胞（含有神经干细胞和嗅鞘细胞）也是其中的一种。由于其具有向神经元、神经细胞分化的特性，多应用于神经修复等。但其在OA 治疗及软骨修复方面鲜有应用。

2 不同来源的MSCs治疗OA的临床研究

2.1 BM-MSCsHeck等［13］发现了一种新的PPARd 激动剂HA 凝胶和BM-MSCs 的组合，可在人OA 滑液中形成Ⅱ型胶原分泌的功能型软骨细胞。Xia等［14］发现LIPUS通过整合素-mTOR信号传导途径影响TGF-β 介导的软骨形成分化。Qi 等［15］发现BMSC-Exos（BM-MSCs 外泌体）通过抑制p38 和ERK1/2的磷酸化以及刺激Akt信号通路的磷酸化而部分抑制这一过程。这在一种新的非细胞OA 治疗方法中具有很大的潜力。目前BM-MSC 治疗OA 的临床研究中，关于细胞数量、注射次数对疗效的影响仍存在争议。Chahal 等［16］于2015 年4 月至2017 年12 月在加拿大进行了临床试验，研究12 例KOA 患者单次关节腔注射自体BM-MSCs（106，10×106，50×106）治疗OA 的作用，结果显示均可改善晚期OA 患者的被动关节活动度（PROM）和西安大略和麦克马斯特大学OA指数（WOMAC），且BM-MSCs的浓度越高其软骨保护作用，高剂量还显示滑膜炎评分显著降低。Gobbi等［17］通过对50例患有Ⅳ级膝关节软骨损伤的患者进行HA-MSCs（含BM-MSCs 的透明质酸C基支架）或微骨折治疗，进行2 年（短期）和5 年（中期）的前瞻性观察，发现微骨折或HA-MSCs 均可获得积极的短期临床疗效，在中期随访时HA-MSCs提供了更好的临床结局和更持久的软骨修复。Legendre 等［18］诱导老年OA 患者的BM-MSCs 成软骨分化时发现其干细胞标记物非一致阳性且增殖潜能低，低氧环境中联合应用BMP-2 和TGF-β1 获得了最好的软骨细胞表型，使用RNA 干扰策略来阻止骨关节炎过程中软骨主要标志物的合成和蛋白酶的过度表达，从而改善软骨形成谱系。

2.2 AD-MSCsTang 等［19］探讨皮下或内脏脂肪组织的AD-MSCs是否对OA 有同样的改善作用时发现皮下脂肪组织来源的干细胞向软骨细胞分化、抑制免疫反应，是OA 细胞治疗的有效细胞来源。Liu等［20］通过研究AD-MSCs的关节内注射OA 小鼠膝关节腔发现，上调BMP9 蛋白表达可促进AD-MSCs 向软骨方向分化，且AD-MSCs 通过Notch1/Jagged1 信号通路促进OA 关节软骨修复。Ko 等［21］发现SOX-6，9转染诱导AD-MSCs体外软骨形成效果与生长因子处理相当，且最佳剂量的SOX-6，9、AD-MSCs可延缓山羊手术诱发的OA 进展。Zhou 等［22］发现ADMSCs 通过自噬诱导减轻骨关节炎和软骨细胞凋亡从而减轻大鼠OA 模型的骨关节炎。Spasovski 等［23］对9例诊断为OA的患者，单次注射0.5-1×107细胞的AD-MSCs 进行治疗，随访18 个月并进行临床评估、X线平片、MRI可视化等评分。前6个月临床评分均有明显改善，X线平片未见明显改善或进一步退变。Jo 等［24］对18 例膝OA 患者分组给予关节腔内注射低、中、高剂量组（依次为1×107、5×107和10×107）ADMSCs 进行两年的临床和结构评估发现关节内注射自体AD-MSCs 可改善膝关节功能，并可减少膝关节疼痛时间最长可达2年，与细胞剂量无关。Lee等［25］进行一项关于关节内注射AD-MSCs 治疗膝关节OA的疗效和安全性的Ⅱb 期临床试验。单次AD-MSCs关节腔治疗12 例（MSC 组），并与12 例膝关节注射等渗盐水（对照组）进行比较，观察6 个月。通过WOMAC评分及各种临床和影像学检查发现MSC组6 个月时的WOMAC 评分显著改善，在MRI 上，MSC组6 个月时软骨缺损无明显变化，而对照组软骨缺损明显增多。

2.3 UCB-MSCsJeong 等［26］发现UCB-MSCs 可促进TSP-2 通过PKCA、ERK、p38/MAPK 和Notch 信号通路诱导的内源性软骨前体细胞的分化，从而促进软骨再生。Gomez-Leduc 等［27］将UCB-MSCs 通过结合Ⅰ/Ⅲ型胶原海绵的3D 培养和诱导因子的培养方法进行软骨细胞的传代，之后进一步发现该培养方法应在常氧条件下开始，以获得更有效的软骨细胞分化，然后将其置于缺氧中以稳定软骨细胞表型［28］。Li 等［29］将UCB-MSCs 与人关节软骨细胞直接共培养，结果显示细胞比例为5∶1时，具有诱导效率高、成本低、避免软骨细胞发生去分化、可稳定保持软骨表型等优点，在缺氧环境下UCB-MSCs 向软骨细胞分化可避免软骨肥大的发生。Park 等［30］首次以Cartistem 的药用产品（同种异体UCB-MSC与透明质酸水凝胶复合物）为基础的OA 临床试验，并进行长达7 年的临床观察，研究表明新型干细胞药物的应用对骨关节炎膝关节中持久性关节软骨的再生是安全有效的。

2.4 S-MSCsMatsumura 等［31］用IL-1β 预处理增强了S-MSCs的增殖和软骨形成潜力。Kubosch等［32］在S-MSCs和软骨细胞体外共培养的实验中，发现软骨细胞的旁分泌作用可诱导S-MSCs 产生软骨表型并促进TGF-β 分泌，这种共培养方法具有软骨修复功能。崔岩等［33］将OA 患者的关节液加入诱导后的SMSCs培养液中，发现OA关节液有促进S-MSCs软骨分化后软骨基质合成的作用。Mak等［34］将分离出的具有软骨形成能力的小鼠S-MSCs 注射到软骨损伤后的小鼠关节内中，发现经Sca-1 纯化的小鼠SMSCs在体外和体内均具有向软骨细胞分化的能力，可防止通常手术诱导的局灶性软骨缺损后的关节退化。Ozeki等［35］发现定期关节腔注射S-MSCs可维持其活性并抑制大鼠OA 的进展。但目前鲜有关于S-MSC 治疗OA 的临床应用文章报道，S-MSCs 治疗软骨损伤有诸多优越性，显示出其理想的应用前景，但应用S-MSCs治疗损伤软骨组织的安全性和可行性还有待更广泛研究证实。

2.5 SF-MSCsJia 等［36］使用MSC 表面标记CD90进行了磁激活细胞分选（MACS）成功地纯化了SFMSCs，且在微团培养中也能产生软骨组织，之后进一步探究兔SF-MSCs包裹在可注射性壳聚糖基水凝胶中修复兔股骨髌骨沟槽软骨缺损的能力时，发现这一新策略能有效促进全层关节软骨再生修复软骨缺陷［37］。Ou 等［38］通过在SF-MSCs 中的过表达lncRNA ZBED3-AS1，上调ZBED3 的表达通过Wnt 通路增强了修复软骨细胞的潜力。Garate 等［39］评估了PRP∶SF 体积比为3∶1，1∶1 和1∶3（体积/体积）的SFMSCs 与富血小板血浆（PRP）混合制备透明质酸生物支架，其中PRP-SF 比率为1∶3 的配方比其他配方表达更多的Ⅱ型胶原，且固化细胞分泌uPA 和降解形成的纤维蛋白凝块降低了SF-MSCs的纤溶能力和生物支架提供的软骨分化潜能。Neybecker 等［40］发现晚期OA 患者来源的SF-MSC 的具有干细胞特性，且在胶原海绵与诱导因子（单独的TGFβ1 或与BMP2 组合）共同作用下表现出良好的成软骨和细胞外基质合成的能力，但在SF-MSCs 的关节内注射对OA 大鼠的关节病变未产生任何有益或有害的影响。

2.6 其他来源的MSCs

2.6.1 UC-MSCsFernandez-Pernas 等［41］从UCMSCs 经球形细胞定分化为软骨细胞样细胞中发现5-三碘-L 甲腺原氨酸（T3）在一定程度上通过SRC2介导刺激软骨形成过程而不刺激肥大，且T3的成软骨作用是通过Wnt途径独立于LRP5/6 组分调控的。Ding 等［42］证明hUC-MSCs 对碘乙酸一钠（MIA）诱导的小鼠关节软骨损伤具有保护其免受MIA 诱发的软骨细胞凋亡。Matas 等［43］在膝关节OA 患者Ⅰ/Ⅱ期试验中随机分为3 组，分别于对照组（（HA）、单次组（UC-MSC×1 次）、重复组（UC-MSC×2 次）6 个月。12 个月后进行WOMAC 评分和疼痛视觉评分、MRI评分，在随访1 年，发现重复组较单次UC-MSC 及透明质酸治疗OA 膝关节为膝OA 患者带来了良好的安全性和改善了长期疼痛的临床效果。

2.6.2 NM-MSCsGe 等［44］通过SDS-PAGE 和LCMS 研究OM-MSC 的分泌蛋白组。共鉴定出274 种分泌蛋白。已知这些分子在神经营养，血管生成，细胞生长，分化和细胞凋亡以及炎症中是重要的，这表明OM-MSC 移植可显着改善OA 的进展。虽然目前NM-MSCs具有大量优点，但其跨胚层分化为透明软骨细胞的基础实验及治疗OA 的应用，国内外均极少。

3 结语与展望

MSCs 治疗OA 及软骨修复是近年来临床医学领域的研究热点，MSCs对膝关节软骨修复已表现出明显的治疗优势，从临床上初步研究了不同来源的MSCs 膝关节软骨修复疗效，其来源丰富，各具一定的优势和局限性，在软骨修复中发挥着重要的作用。目前临床研究仍处于试验阶段，用于OA 治疗的3 种主要方式修复：①直接关节内注射MSCs；②手术植入含有MSCs 的支架复合体；③MSCs 外泌体通过旁分泌修复软骨、减缓OA 进展。尚无确切定论何种干细胞及何种技术处理最适合于人类软骨的修复，这需要大规模或结合新处理技术的临床试验以及远期临床效果的验证，也为今后临床的深入研究提供基础。比较BM-MSCs、AD-MSCs 来说，滑膜、脐带血以及其他如牙髓、鼻黏膜等组织来源的MSCs在临床研究中尚不多，未来需要对这些干细胞进行更多的临床试验以评估其是否适合人类关节软骨的修复及OA 治疗。同时，要增进对MSCs 生物学功能更深层次的认识，尤其是其作用机制，继续探索更适于修复软骨和治疗OA 的天然或人工合成支架材料以及促进软骨修复的生长因子，使新生软骨更接近自体软骨的生物学和机械特性。通过对这些问题的进一步研究，挖掘MSCs 治疗OA 的临床最佳方法，这对未来骨科领域发展有重要的临床价值。近年来，以干细胞、精准医疗为核心的再生医学，已成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径，国内外干细胞已被应用至膝OA 的治疗中，随着临床研究的进一步发展，相信广大OA 患者能从中改善疼痛等症状、延缓OA进展。