中性粒细胞胞外诱捕网在脓毒症及肠屏障功能中的研究进展

胡琼源综述，任建安审校

0 引 言

脓毒症是导致重症患者死亡的重要因素，早期诊疗对脓毒症的预后极具意义［1］。目前早期诊断脓毒症的标志物敏感性较低。2004年，Brinkmann等［2］首次发现中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），并阐明NETs 结构及其作用。随后研究发现NETs 有望成为脓毒症早期诊断的新型标记物。早期NETs 的形成可抵御病原微生物入侵，但近来研究证实，持续过度的NETs 可诱导炎症放大、促进组织损伤，引起肠屏障损伤及免疫功能紊乱。本文就NETs 与脓毒症及肠屏障功能障碍最新研究进展作一综述。

1 NETs的形成机制

1.1 NETs的基本特征中性粒细胞在多种微生物或炎症介质的刺激下活化，通过氧化应激、炎症介导等作用，向胞外释放一种以DNA 为骨架的网状结构，内含组蛋白、弹性蛋白酶等抗菌蛋白，称之为NETs。电镜下结构表现为15～17 nm 长度的平滑肌纤维和25 nm 左右镶嵌于DNA 骨架的球形区域［2］。NETs依赖于特有的三维网状结构捕获病原菌，并通过抗菌蛋白杀灭病原体。

1.2 NETosis-释放NETs 死亡方式NETs 的形成过程被称为NETosis。2007 年，Fuchs 等［3］首次发现一种新型的细胞死亡过程，即NETosis。与凋亡不同的是，NETosis 不会出现DNA 碎片化，同时不依赖于caspase 级联。NETosis 与坏死过程也存在差异，NETs形成早期即出现细胞核囊泡化，使得解聚的染色质和抗菌物质在释放前相互结合。NETs 成型后以线状、网状等多种形态聚集中性粒细胞周围，或以棉絮状游离于循环之中。当NETs 的形成与清除失衡，则具有细胞毒性作用，参与炎症放大及血栓形成等病理过程。近年来研究发现，肽基精氨酸脱亚氨酶4（peptidyl arginine deaminase 4，PAD4）对于NETs 形成发挥重要作用［4］。脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）则被证实能够有效降解NETs。

2 NETs在脓毒症中的正面作用

NETs 通过电荷间相互作用与病原微生物相互结合，实现诱捕细菌。NETs 能够结合弗氏志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，白色念珠菌和利什曼原虫等多种病原微生物。Buchanan等［5］使用表达DNase 的A 组链球菌处理小鼠，皮肤病变更严重，细菌传播更广泛。这提示NETs 不仅能够杀灭细菌，还能阻碍细菌传播。McDnald 等［6］利用荧光标记大肠杆菌，分析LPS 处理小鼠后肝脏内细菌诱捕情况，结果提示，当肝内巨噬细胞被广泛的菌血症淹没时，肝内NETs 将会诱捕细菌。具有快速降解DNA 能力的微生物毒性更强。如肺炎链球菌表达的endA 可降解DNA，从而破坏NETs，因此可加剧脓毒症的发生发展。NETs通过其组分组蛋白，组织蛋白酶G 和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）发挥抗菌活性。近来研究证明，NETs 可通过MPO和组织蛋白酶G 激活IL-1 和IL-36 等细胞因子［7］。NETs 捕获细菌依赖于DNA 网状结构，一旦核酸酶破坏其结构，NETs抗菌结构就消失。

3 NETs在脓毒症中的负面影响

虽然NETs 在脓毒症早期通过限制细菌的增殖及播散保护机体，但脓毒症过程中过度NETs 的形成会导致组织损伤。NETs 在脓毒症中扮演“双刃剑”作用，在发挥抗病原微生物同时，也能够促进血栓形成，引起弥漫性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）及器官功能障碍的发生，最终导致脓毒症患者死亡率增加。

3.1 NETs与血栓形成脓毒症时大量的炎症因子引起系统性炎症反应，诱发凝血系统的激活。正常生理下，抗凝通路（包括有组织因子信号，抗凝血酶，血栓调节蛋白等）能够防止过度的血栓形成，但是在脓毒症过程，持续的凝血信号将会打破抗凝系统，引起血管内凝血。最终机体的凝血蛋白以及血小板的耗竭导致凝血功能障碍或DIC。脓毒症晚期DIC 表现为出血或MOF。研究证实，NETs 通过促进血栓形成，激活血小板，抑制抗凝通路等途径诱导DIC［4］。临床观察发现脓毒症患者循环高表达游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），且通过多种途径影响血栓形成［8］。Gould 等［9］发现血浆中cfDNA 水平与凝血酶生成的程度和速率呈正相关。cfDNA 凭借其双链DNA 结构结合蛋白因子XII 和激肽，加速前激肽释放酶的激活，促进凝血进程。此外，cfDNA 不仅通过抑制组织纤溶酶原激活剂来损伤纤维蛋白溶解，还通过构建红细胞、血小板、纤维蛋白和凝血因子结构的支架强化微血栓超微结构［4］。除cfDNA，NETs 其他组成成分（细胞外组蛋白，中心粒细胞弹性蛋白，组织蛋白酶G）同样发挥促凝血作用。研究证实，阻断NETs能明显改善脓毒症小鼠DIC凝血指标及微循环灌注。

3.2 NETs与器官功能障碍

3.2.1 NETs 与肺损伤急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是临床上常见危重症，进展形成急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ARDS是脓毒症的致命性并发症，特征表现为肺泡-毛细血管屏障的破坏，引起内皮和上皮细胞的通透性增加，导致高蛋白性水肿甚至呼吸衰竭。中性粒细胞从脉管系统迁移到间质和支气管肺泡腔是脓毒症并发ARDS 的关键特征。研究发现，脓毒症过程中NETs 被激活，并诱导ALI 发生［10］。Maruchi 等［11］发 现 循 环 中MPO-DNA 水 平 与 氧 化 指 数PaO2/FiO2呈正相关。Mikacenic 等［12］发现ARDS 患者肺泡灌洗液中NETs 表达较循环NETs 更高，进一步研究证实，肺泡中NETs 可激活炎症应答，导致肺部局灶性炎性损伤。体外研究表明，NETs可改变上皮细胞的肌动蛋白细胞骨架增加肺泡上皮细胞通透性；NETosis 过程中释放到胞外的组蛋白也可加剧中性粒细胞的积聚迁移，并引起肺泡上皮的直接破坏，导致肺泡通透性屏障的破坏。机制上，NETs可通过激活TLR4 或NLRP3 等信号通路诱导炎症介质大量分泌，导致肺功能障碍［13］。

3.2.2 NETs 与肝损伤脓毒症中，库普弗细胞和肝内皮细胞招募大量中性粒细胞。中性粒细胞通过NETs 发挥抗菌作用，实现抗感染。这个过程使肝脏成为脓毒症中NETs 形成的中心器官。然而，过度NETs 的形成也会导致肝和其他宿主器官的细胞受损。虽然组蛋白和中性粒细胞弹性蛋白酶具有抗菌能力，但是他们对宿主上皮细胞和内皮细胞也有毒性。重要的是，NETs固定在肝窦上的时间长达24 小时［14］。DNase 虽然能够降解DNA，但无法去除任何蛋白，只能部分降低蛋白酶解活性或相关的肝毒性。在脓毒症早期阶段，适度的NETs 形成能够杀灭细菌，改善组织损伤，在脓毒症中晚期，过度的NETs 形成将会介导炎症因子大量分泌，导致肝组织损伤。因此，深入了解NETs 形成机制有助于及时进行脓毒症治疗。

3.2.3 NETs 与肾损伤肾是脓毒症的易损器官，严重脓毒症患者中，22%～53%合并急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）。AKI特征表现为管状上皮细胞坏死、血管内皮细胞损伤以及强大的组织炎症。Nakazawa 等［15］发现急性肾小管坏死患者肾组织高表达NETs 组分，且NETs 可诱导坏死性炎症。在急性肾损伤过程中，管状上皮细胞的坏死是导致损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）释放和NETosis 诱导的始动因素。DAMPs 可诱导大量的NETs 形成。NETs 及其组分可作为坏死性炎症的介质，诱导肾小管上皮细胞广泛性损伤。肾小管细胞坏死和NETs 形成之间以“恶性自循环”方式加重肾损伤，并诱导MOD。Biron等［16］发现在脓毒症模型中，降低NETs 形成可下调肾组织炎症因子，肌酐及尿素氮水平，明显改善脓毒症导致的肾功能障碍。

4 NETs在肠屏障功能发挥的作用

胃肠道中的许多细菌，真菌和寄生虫可刺激NETs 形成。NETs 能够有效的防止病原体入侵，发挥防御功能。然而，活化的中性粒细胞和肠上皮细胞共培养时，NETs及其组分可损伤肠上皮［17］。虽然NETs能够清除有害菌，控制肠源性感染，但NETs也可诱导肠道炎症应答。研究发现，Ⅰ型糖尿病患者循环NETs 表达与肠屏障损伤标志物（连蛋白及LPS）呈正相关，这提示NETs 升高与肠渗透性增高密切相关［18］。Dinallo 等［19］发现，用LPS 或TNF-α 处理溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）外周血中性粒细胞，可明显诱导NETs 形成。此外，在UC 患者肠黏膜中表达NETs 标记物，且肠管炎症活跃区域NETs表达更加明显。通过NETs刺激肠原代固有层单核细胞，可明显诱导IL-1β 和TNF-α 分泌，但DNase 预处理能够消除NETs 的促炎效应。此外，在儿童炎性肠病肠黏膜中NETs 同样高表达，并且参与肠黏膜炎症反应与免疫应答［20］。由此可见，NETs在肠道黏膜炎症发挥重要的作用。Gao 等［21］发现脓毒症时，NETs 能够损伤肠道黏膜。LPS 造模后，免疫荧光观察到大鼠肠组织中有大量中性粒细胞浸润，且可观察NETs 广泛分布在大鼠肠固有层中。DNase处理后，肠黏膜中产生的NETs被有效降解，且可有效降低肠细胞凋亡指数，改善肠道炎症。在肠缺血再灌注模型中，静脉注射DNase 可明显改善NETs参与的肠屏障损伤［22］。

NETs参与肠屏障损伤的机理十分复杂。首先，NETs 或其组分可直接诱导细胞死亡及肠细胞大量凋亡，诱导肠黏膜损伤；再者，NETs被证实可损伤血管内皮细胞，引起血管通透性增加，影响组织氧化作用，这为NETs 可损伤肠道微循环，损伤肠黏膜血管提供理论依据；最后，NETs 的炎症放大作用也是脓毒症中肠屏障损伤的重要因素。对于脓毒症中NETs导致肠屏障损伤的机制有待进一步阐明。

5 NETs的临床应用

脓毒症临床预后依赖早期识别和及时干预，临床检测NETs 水平有望成为早期诊断脓毒症重要的标记物。前期证实，通过ELISA，流式技术等方法检测cfDNA，组蛋白及核小体等能够体现NETs形成的程度。Maruchi等［23］证明NETs在脓毒症早期阶段快速形成，且参与脓毒症休克发生的病理生理机制。此外，针对NETs 产生及组分的治疗性干预有望成为脓毒症临床治疗的新策略新方法。Mai 等［24］发现延迟性（CLP后2 h）腹腔注射DNase可降低循环cfDNA 及炎症介质，改善组织损伤，降低菌群易位。同时，DNase 和抗菌素联合治疗效果更加显著。这揭示了，通过联合DNase和临床常规治疗手段（液体复苏、抗生素等）可优化脓毒症临床治疗疗效。

鉴于PAD4 在脓毒症诱导NETosis 形成发挥的重要作用，可将其作为合适的治疗靶点。在狼疮小鼠模型中，PAD4 抑制剂能够保护NETs 介导的血管损伤、内皮功能障碍和肾损伤［25］。在脓毒症模型中，PAD4 敲除可改善生存率并降低器官功能障碍的严重程度［26］。除PAD4，citH3 也是脓毒症治疗潜在的治疗靶点。Li 等［27］发现在脓毒症中，中和循环citH3 能够改善小鼠生存率。通过非抗凝血肝素结合citH3 可明显降低组蛋白介导的细胞毒性，改善LPS 导致的肺损伤，提高脓毒症小鼠生存率［28］。阻断NETs形成或降解NETs组分在脓毒症小鼠模型的治疗疗效已得到证实，但未见临床试验证实NETs相关措施治疗脓毒症。今后需要开展临床试验验证以NETs为靶点，探讨在脓毒症中的疗效。

6 结 语

脓毒症中NETs 的形成可诱导炎症应答，血栓形成及器官功能障碍。通过调节NETs 的形成，释放等多个靶点可阻断NETosis，阻断炎性反应与凝血的相互作用，为脓毒症治疗提供新的治疗思路和方向。但由于NETs 结构的特殊性，目前其浓度检测尚未用于临床。今后，需进一步完善、精确NETs检测，实现脓毒症临床预后的早期识别。