DNA损伤修复在肝细胞癌发生发展及治疗过程中的作用

余 良，宋瑞鹏，孟凡征，刘连新

(哈尔滨医科大学附属第一医院肝脏外科，哈尔滨 150001)

肝细胞癌(hepatocarcinoma,HCC)是源自肝细胞的原发性肝癌，占所有原发性肝癌的85%～90%，是男性的第五大常见癌症，也是世界上女性的第七大常见癌症[1]。估计每年新发病例数约为78.2万例，每年造成60万人死亡，其病死率高和生存时间短导致严重的全球健康负担[1]。HCC的发生是遗传以及环境因素相互作用的复杂过程，其机制尚未完全阐明，重要的危险因素包含慢性病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉毒素等环境毒素，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、饮酒、吸烟和饮食因素等生活方式因素[2]。各种HCC相关的风险因子能够造成DNA损伤，损伤的DNA若未及时正确修复可导致基因改变和基因组不稳定，被逐渐认为是人类HCC的共同特征。DNA损伤修复过程失调与肝癌易感性相关，并且该过程在HCC细胞中往往增强，导致针对HCC细胞的抗癌治疗效果不甚理想[3]。现就DNA损伤修复在HCC发生、发展及治疗过程中的作用进行综述。

1 DNA的损伤修复过程

DNA损伤修复的失调是HCC发生、发展的重要机制。在肝细胞内，从最基础结构的碱基损伤到磷酸二酯键的断裂，构成DNA的结构都可能发生损伤，包括碱基突变、核苷酸缺失、插入、双链断裂等[4]。外源性理化因素，机体正常代谢活动中产生的活性氧和活性氮，甚至机体自发的水解反应都可能造成DNA损伤[5]。正常生物体有相对完善的DNA损伤修复机制来修复由各种原因引起的DNA损伤，为了避免DNA损伤导致潜在的突变情况，细胞会通过某些反应修复损伤或激活程序性凋亡：①修复DNA损伤并恢复DNA双链连续性；②激活DNA损伤检查点，阻止细胞周期进展，以避免受损染色体的复制；③转录反应；④细胞凋亡途径，消除严重受损或严重失调的细胞。DNA损伤修复方式包括核苷酸切除修复、碱基切除修复、同源重组修复、错配修复。损伤发生时，细胞内损伤受体如毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ataxia telangiectasia-mutated protein，ATM)和Rad3相关蛋白以及Rad9-Rad1-Hus1蛋白质复合体等率先进行DNA损伤检测，随即启动检验点激酶1和2以及细胞周期调控因子的信号转导级联反应；后者进而通过激活p53并抑制细胞周期依赖性激酶实现G1、S、G2/M期细胞周期阻滞，使细胞在成功修复后得以重新进入细胞周期。一旦细胞中的DNA无法被修复，此时细胞就会进入凋亡通路，引导细胞进行自我凋亡，以防止DNA的相关损伤向子代进行传递[6]。

2 肝癌致病因素与DNA损伤修复

目前肝癌的病因尚未完全明确，随着分子生物学技术的发展，分子层面对肝癌的致病机制进行了深入研究，初步揭示了各种肝癌的致病因素(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、胆汁酸、黄曲霉菌素等)在不同水平上造成不同程度的DNA损伤，尤其是在修复过程中一些潜在的致癌机制及重要基因不断出现。

2.1乙型肝炎病毒与DNA损伤修复 慢性乙型肝炎病毒感染显著增加了HCC的发生风险，其编码的乙型肝炎病毒X蛋白是一种长度为154个氨基酸的蛋白质，在转录水平的反式激活病毒基因表达中具有重要作用[7]。Na等[8]研究发现，乙型肝炎病毒X蛋白通过与聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶1的相互作用抑制DNA修复复合物向受损DNA位点的募集，从而抑制DNA损伤的修复，可能导致肝癌发生。Martin-Lluesma等[9]发现乙型肝炎病毒X蛋白与DNA损伤结合蛋白1结合,干扰S期进程导致染色体分离缺陷，形成异常的有丝分裂纺锤体和多核细胞，促进肝癌的产生，解释了乙型肝炎病毒引起的HCC染色体异常率高于其他致病因子的原因。与线粒体相关的乙型肝炎病毒X蛋白可诱导肝细胞氧化应激，产生丰富的活性氧诱导氧化性DNA损伤并导致8-羟基-2-脱氧鸟苷蓄积，可能是乙型肝炎病毒X蛋白的致癌机制[10]。研究表明[11],乙型肝炎病毒X蛋白最初诱导DNA损伤，然后破坏核酸代谢，进而阻止DNA修复并诱导HCC的发生,但其完整机制仍在探索中。

2.2丙型肝炎病毒与DNA损伤修复 丙型肝炎病毒属于RNA病毒，现全球约有1.7亿人感染[12]。丙型肝炎病毒感染是肝癌已广泛证实的重要致病因素。丙型肝炎病毒可导致氧化应激水平升高，增加DNA损伤的发生。Machida等[12]研究发现丙型肝炎病毒核心和非结构蛋白3的表达激活诱导型一氧化氮合酶基因导致细胞DNA中一氧化氮的产生增加和DNA双链断裂的形成，但E1蛋白的表达不通过产生一氧化氮而增加DNA双链断裂。随后的研究表明丙型肝炎病毒感染导致线粒体膜电位降低和活性氧水平的增加，核心蛋白、E1蛋白和非结构蛋白3的个体化表达能够诱导活性氧进而导致DNA双链断裂增加[13]。Shawki等[14]的单细胞凝胶电泳实验结果显示，丙型肝炎病毒诱导的HCC和肝硬化患者外周血淋巴细胞的DNA损伤程度较高，出现DNA损伤的患者患肝癌的风险是无DNA损伤者的3.6倍。Pham等[15]研究发现丙型肝炎病毒下调泛素结合酶E2S的表达阻止非结构蛋白5A的蛋白酶体降解，使宿主细胞对DNA损伤更加敏感，该途径可能是丙型肝炎病毒诱导的肝脏发病机制。Higgs等[16]发现丙型肝炎病毒感染后Gadd45beta表达下调，Gadd45beta启动子的高甲基化是造成这种缺陷的原因。其下调导致异常的细胞周期停滞并减少DNA切除修复。在肝脏中丙型肝炎病毒感染和复制并不均匀并且存在个体肝细胞差异,Wang等[17]发现低丙型肝炎病毒载量的谷胱甘肽过氧化物酶2、减数分裂重组蛋白11、磷酸化ATM和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶发生表达上调的现象，高载量者反而下调，而在辐射下低载量者中表现出更强的存活能力。这一反常结果的原因可能是细胞内病毒载量驱动细胞DNA损伤水平但抑制了与损伤相关的基因表达，尚不排除来自高载量细胞的活性氧的影响。这些发现为丙型肝炎病毒感染细胞中不同病毒载量引起的不同DNA损伤和修复反应提供了新的见解，并有待深入探索。

2.3黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)与DNA损伤修复 饮食中AFB1暴露是肝癌发生的主要危险因素，Weng等[18]发现超过60%的AFB1相关的HCC携带p53密码子249突变，在AFB1的两种反应途径中，脂质过氧化途径占绝对优势，并对核苷酸切除修复、碱基切除修复和错配修复产生抑制作用，导致肝细胞突变敏感性增加。Yao等[19]在一项纳入1 486例HCC患者和1 996名对照者的对照研究发现，与对照组相比，AFB1暴露组和修复基因突变组HCC风险均增加，并且通过交互分析得出两者可能存在相互作用。微囊藻毒素-LR(L:亮氨酸，R:精氨酸)与AFB1常共存于温湿地区的污染食物和水中，同为致癌毒素。Liu等[20]的研究发现，同时暴露于微囊藻毒素-LR与AFB1的人肝细胞系HL7702发生了碱基切除修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1的表达上调，与单独暴露于等量的AFB1或微囊藻毒素-LR相比，表现出显著增加的DNA损伤。此外在无AFB1暴露的情况下，微囊藻毒素-LR可显著下调碱基切除修复基因8-氧鸟嘌呤糖基化酶1的表达从而抑制损伤修复，但其具体机制及修复蛋白活性的变化情况有待进一步阐明。

2.4胆汁酸与DNA损伤修复 胆汁酸主要由肝细胞合成分泌，是肝脏微环境的组成部分，影响着细胞信号转导并调节抗细胞凋亡基因的表达和细胞增殖[21]。甘氨鹅脱氧胆酸钠(glycochenodeoxycholate，GCDA)是胆汁酸中的重要代谢成分，具有毒性和疏水性。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，在多种肿瘤中高表达。Zhou等[22]发现肝癌细胞中GCDA作用于环状结构的Ser70位点使Bcl-2磷酸化，激活其抗凋亡作用，是GCDA诱导肝癌细胞耐药的机制。Mcl-1是Bcl-2家族中的重要抗凋亡成员，在约50%的HCC患者中过表达，提示Mcl-1是一种潜在的治疗靶点[23]。Liao等[23]发现GCDA于T163位点磷酸化Mcl-1，使其与泛素连接酶解离，增强了Mcl-1的抗凋亡功能，导致肝癌细胞长期存活或耐药。Yu等[24]提出GCDA抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶并促进Mcl-1在细胞核中积累阻碍碱基切除修复过程，亦证明MCL-1是GCDA诱导HCC过程中的重要因子。

2.5NAFLD与DNA损伤修复 NAFLD是发达国家慢性肝病的最常见原因，波及其1/3人口总数。非酒精性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是NAFLD疾病谱的重要组成疾病，以肝细胞损伤和炎症为特征，且可能发展为HCC[25]。近年来提出的机制为“多重打击”假说，这些打击包括胰岛素抵抗，来源于肠道微生物群和脂肪组织的脂肪细胞因子等[26]。Gentric等[27]发现NASH患者肝脏中多倍体单核细胞数量增加，并伴有氧化应激介导的G2/M期DNA损伤检查点的激活和缓慢的S/G2细胞周期进展。NAFLD小鼠模型中抗氧化剂治疗阻止了多倍体的发展，支持了调控活性氧水平可以预防疾病进展的观点。在酒精性肝损伤的活性氧中，细胞色素P450 2E1的诱导起主要作用[28]，这也可能是NAFLD中活性氧导致损伤的机制。研究发现，NASH患者肝脏中细胞色素P450 2E1的表达增加，表明细胞色素P450 2E1与NAFLD患者肝脏中活性氧的产生有关，但具体机制尚未明确[29]。Seki等[30]发现NAFLD患者的脂质过氧化标记8-羟脱氧鸟苷的水平增加，而少见于正常肝脏。Tanaka等[31]发现，与无HCC的NASH相比，由NASH进展的HCC中8-羟脱氧鸟苷阳性肝细胞的比例显著增加。总之，这些数据表明氧化性DNA损伤随着NASH进展而增加。值得注意的是，Fujita等[32]报道在铁还原疗法后，NASH患者肝脏中8-羟脱氧鸟苷水平显著降低。因此，铁过载可能是NASH患者氧化性DNA损伤的重要原因。

3 HCC的治疗与DNA损伤修复

化学药物治疗几乎是大多数无手术必要的晚期HCC患者的唯一选择，并且HCC对大多数化疗方案表现不同程度的耐药性，导致可用于HCC的化疗药物较少。因此，迫切需要对HCC化疗耐药进行深入研究并开发新的化疗策略。许多常规的化疗药物通过诱导HCC细胞DNA双链断裂而发挥作用，HCC细胞通过强化其非同源末端链接活性来抵消由化疗药物造成的DNA损伤，常导致其化疗耐药。Yang和Wang[33]研究发现HCC患者的X线修复交叉互补基因4组改变率低，但在经导管肝动脉化疗栓塞术治疗后X线修复交叉互补基因4表达增加。临床上，X线修复交叉互补基因4的高水平表达与晚期HCC较低的总体存活率显著相关，表明敲除X线修复交叉互补基因4的体外和异种移植肿瘤模型对化学治疗敏感，X线修复交叉互补基因4促进癌细胞非同源末端链接活性，因此抑制X线修复交叉互补基因4表达的靶向药物可以通过抑制DNA修复水平增强化学药物的敏感性，可成为常规化疗的有效辅助用药。DNA依赖蛋白激酶催化亚基是非同源末端链接的核心组件，抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚基活性使HCC细胞对DNA双链断裂修复减弱。肝癌的各种组织学分型中，HCC的DNA依赖蛋白激酶催化亚基表达的阳性比率最高[34]。DNA依赖蛋白激酶催化亚基不仅可以保护肿瘤细胞免受来自微环境或化学治疗药物治疗的有害DNA损伤，而且还具有独立于其DNA修复活性的额外特性，是治疗HCC的潜在靶点[35]。Chen等[36]研究发现褪黑素诱导长链非编码RNA Rad51-AS1的表达，降低HCC细胞的DNA修复能力，动物模型中进一步证实，与单一疗法相比，依托泊苷联合褪黑素抑制肿瘤生长效果增强。褪黑激素除抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力外，还抑制其DNA修复能力，从而增强放化疗的细胞毒性，是潜在的辅助治疗。微RNA(microRNA,miRNA/miR)的表达在肿瘤抑制中起作用，Luo等[37]研究发现过表达的miR-146a-5p通过激活DNA修复途径和下调复制蛋白A基因，有助于抑制细胞增殖和增强放射敏感性，使HCC发生凋亡，miR-142-5p的进一步大规模研究有助于为HCC寻找新的有效治疗途径。Al-Hrout等[38]对藏红花醛在HCC中的治疗机制进行深入探索， 在体外实验和生物模拟实验中，通过内质网的应激，诱导DNA双链断裂并抑制DNA修复，使HCC细胞发生凋亡，这是首次关于藏红花醛在DNA损伤修复途径中作用的研究报道。帕布昔利布是一种口服细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂，可有效治疗乳腺癌。Huang等[39]评估了帕布昔利布联合放疗治疗人类HCC的效果，ATM激酶是放疗诱导的DNA双链断裂的关键上游激酶，帕布昔利布通过蛋白磷酸酶5介导对ATM的抑制作用。体外和体内研究均显示，该过程是帕布昔利布和放疗协同产生的，提供了一种新的联合治疗HCC策略，但其临床试验尚未开展。伊立替康在Ⅱ期临床试验中表现出的剂量依赖性毒性限制了其在HCC治疗中的应用。Shao等[40]发现在HCC细胞系中吉非替尼与伊立替康的活性代谢物SN-38联合显示出协同活性，并且吉非替尼加SN-38诱导的细胞凋亡增强是胱天蛋白酶途径激活的结果。从机制上分析，吉非替尼显著促进Radbi蛋白的泛素-蛋白酶体依赖性降解，抑制DNA修复，引起更多DNA损伤，并最终导致这两种药物的协同作用。此外，在HepG2异种移植小鼠模型中进一步验证了吉非替尼联合伊立替康增加的抗肿瘤功效。这表明重组酶Rad51是一种有前景的靶标，并为研究拓扑异构酶Ⅰ抑制剂和吉非替尼联合治疗HCC的临床试验提供了理论基础。

4 小 结

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、AFB1、NAFLD都可能导致DNA损伤，经过长时间积累后可能导致HCC的发生，各种致病因素对应着潜在的DNA损伤机制并可能存在不同层次的相互作用。DNA损伤修复不仅是HCC发生、发展的重要机制，也是化疗及其他治疗方式效果欠佳的重要原因。目前，医学界对作用于DNA损伤修复的治疗手段开展了许多相关研究，一些相关的基因片段已被准确定位，相关的治疗方案也逐渐被提出，并取得了一些效果。但肝癌中DNA损伤修复的致癌机制仍有待研究，化学药物治疗方案的改良和创新前景广阔，值得深入探索。