急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的研究进展

张 静，张 卓，周 晋

(哈尔滨医科大学附属第一医院血液内科，哈尔滨 150001)

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓系白血病中具有独特形态学和细胞遗传学特征的一种类型，临床以严重的出凝血障碍为特征。APL诱导分化治疗有效，是急性髓系白血病中预后最好的一种亚型，形态学上属于急性髓系白血病M3型，占急性髓系白血病的10%～15%[1]。APL患者中90%以上的分子生物学特征为第15号染色体长臂2区2带上的早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein, PML)基因和第17号染色体长臂2区1带上的视黄酸受体(retinoic acid receptor, RAR)α相互异位产生新的PML-RARα融合基因，该融合基因编码PML-RARα融合蛋白[2]。PML-RARα融合蛋白通过抑制转录的方式阻止细胞分化，导致髓系细胞分化障碍并停滞在早幼粒细胞阶段。PML-RARα是APL发病的分子细胞遗传学基础，是APL的关键驱动突变，具有显性负性调控作用，影响髓系分化、增殖、凋亡及DNA复制和修复[3]。同时，PML-RARα融合基因还是全反式视黄酸与砷剂靶向治疗APL的靶点。除PML-RARα融合基因外，APL的相关融合基因还包括核有丝分裂器蛋白(nuclear mitotic apparatus protein，NuMA)-RARα、早幼粒细胞白血病锌指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger protein，PLZF)-RARα、信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)5B-RARα和核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)-RARα等。它们均涉及第17号染色体上的RARα基因断裂，断裂点位于RARα基因的第2内含子中，导致RARα结构发生异常[4]。APL是临床上第一个针对肿瘤特异性标志分子应用诱导分化进行治疗并取得良好治疗效果的人类恶性肿瘤[5]。现就APL相关融合基因的研究进展予以综述。

1 PML-RARα融合基因

PML基因长约35 kb，含有9个外显子。其蛋白的N端区域含有3个小泛素化分子1修饰位点，在正常细胞中，泛素化的PML蛋白定位于蛋白核小体内，而蛋白核小体呈粗点状分布于细胞核内，未泛素化的PML蛋白定位于细胞质[6]。PML蛋白是一种肿瘤生长抑制因子，其参与髓系细胞的终末分化。与纯合性缺失PML小鼠相比，表达PML的转基因小鼠的APL发病率明显降低，且纯合性缺失PML基因小鼠外周血的成熟粒细胞数目显著低于正常小鼠[7]。同时，PML通过分别募集组蛋白乙酰化转移酶和组蛋白去乙酰化酶至靶基因使其组蛋白乙酰化或去乙酰化，导致靶基因处于转录激活或转录静止状态。此外，PML蛋白还可能通过与Fas死亡结构域相关蛋白的相互作用而诱导Fas依赖的细胞凋亡[8]。

视黄酸是体内维生素A的代谢中间产物，视黄酸类药物包括全反式视黄酸、13-顺式视黄酸和9-顺式视黄酸等多种同分异构体。视黄酸类受体包括视黄酸受体和类视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)两种，分别有α、β和γ 3种亚型。其中，RARα位于细胞核内，属于类固醇激素受体家族成员。视黄酸与RARα结合后，通过调控基因转录进而影响细胞的增殖和分化。RARα功能区含有转录激活结构域、DNA结合区、核定位相关区和配体结合相关区[9]。视黄酸受体作为配体诱导的转录因子形成视黄酸受体/RXR异二聚体，与视黄酸反应元件结合启动下游分化相关基因的转录[10]。

PML-RARα融合基因是第15号染色体的PML基因断裂，第17号染色体上的RARα基因断裂后，通过互换和易位形成[11]。RARα基因是一种视黄酸依赖性转录激活因子，它在前体细胞的诱导分化中起重要作用。而PML-RARα与RARα功能不同，其阻断了粒细胞的分化成熟[12]。由于PML断裂位点位置不同，而RARα的断裂位点恒定在第2内含子，故依据PML上断裂位点的不同，PML-RARα融合基因表达产物能形成3种异构体，即PML基因的第6外显子(断裂点在6内含子内)与RARα第3外显子结合形成长型(L型)PML-RARα融合基因(约占56%)，PML第3外显子(断裂点在3内含子内)与RARα第3外显子结合形成短型(S型)PML-RARα融合基因(约占40%)，PML第6外显子(断裂点在6外显子中)与RARα的第3外显子结合形成变异型(V型)PML-RARα融合基因(约占4%)[13]。每种PML-RARα融合基因表达产物均包含PML的DNA结构域。这些结构域通过显性负抑制作用使细胞的分化凋亡受阻。研究发现，全反式视黄酸作用于PML-RARα融合基因的RARα在转录基因水平诱导APL细胞分化成熟，而三氧化二砷作用于APL在转录后修饰和蛋白质水平发挥诱导细胞凋亡和降解PML-RARα融合基因表达产物的作用[14]。可见，全反式视黄酸和三氧化二砷在诱导APL细胞分化、凋亡和降解PML-RARα融合基因表达产物方面存在一定的协同作用[15]。全反式视黄酸能增强三氧化二砷介导的RXRα磷酸化，从而协同诱导凋亡[16]。

PML-RARα融合蛋白既能下调核酸适配子的表达，又能募集甲基化酶使靶基因异常甲基化，从而干扰正常细胞分化，引起APL的发生和发展。正常PML蛋白以不连续点状形式分布于核体结构中，是核体的组成成分。而在APL细胞中，由于PML-RARα未被小泛素化分子1修饰不能定位于核体中，导致核体结构破坏，故使PML-RARα融合蛋白散在分布于细胞核呈微小斑点，抑制PML正常活性，从而干扰细胞正常分化与凋亡[17]。同时，PML-RARα融合蛋白也通过异常招募组蛋白去乙酰酶和甲基化酶，增加共抑制复合物和视黄酸靶基因启动子甲基化，从而使RAR基因沉默。因此，PML-RARα融合基因阳性APL对全反式视黄酸敏感[18]。

PML-RARα融合蛋白与转录抑制因子及组蛋白去乙酰化酶的结合率远高于RARα蛋白，其结合可抑制RARα蛋白的翻译和转录。视黄酸与PML-RARα融合蛋白中的RARα结合后，一方面可引起PML-RARα融合蛋白构象改变，释放抑制性复合物，结合转录辅助激活因子，促进DNA翻译和转录[19]。另一方面视黄酸作用于PML-RARα融合蛋白，通过泛素-蛋白酶体途径和胱天蛋白酶途径降解PML-RARα融合蛋白，使PML与RARα分离，PML和RARα功能恢复，从而使早幼粒细胞重新分化[20]。三氧化二砷作用于PML-RARα融合蛋白的PML区域，导致PML小泛素化分子修饰，泛素化的PML能够招募泛素连接酶环指蛋白4，形成聚泛素化的PML-RARα。聚泛素化的PML-RARα可以通过泛素-蛋白酶体途径被降解，并解除表达产物对PML或RARα正常功能的抑制，从而解除APL细胞的分化阻滞[21]。且三氧化二砷在血药浓度较高时(>0.5 μmol/L)促进凋亡，在血药浓度较低(0.25～0.5 μmol/L)时诱导分化[22]。此外，雷帕霉素通过提高细胞自噬促进全反式视黄酸降解PML-RARα融合蛋白，而抑制自噬可减少PML-RARα降解。研究显示，砷剂和雄黄等可以增强APL细胞的自噬水平，促进PML-RARα融合蛋白降解及髓系白血病中性粒细胞分化[23]。

2 其他APL变异易位X-RARα融合基因

2.1PLZF-RARα融合基因 PLZF结构包括BTB/POZ(pox virus and zinc finger protein)结构域、第二结构域和C2H2样锌指结构域3个功能区。PLZF具有参与神经系统和胚胎骨骼系统发育、抑制干细胞分化和阻碍细胞生长等作用。其只有定位在细胞核才具有转录调节功能[24]。PLZF-RARα融合基因是由位于第11号染色体长臂2区3带的PLZF与第17号染色体长臂2区1带的RARα相结合形成。PLZF-RARα融合蛋白与RAR竞争结合视黄酸反应元件和RXR，干扰RARα/RXR信号转导，且通过辅助抑制分子募集与BTB/POZ结合形成复合物，抑制粒细胞生长分化因子表达。因此，PLZF-RARα融合基因阳性APL对全反式视黄酸耐药[25]。

2.2NPM-RARα融合基因 NPM基因位于第5号染色体长臂3区5带，含有12个外显子。NPM具有N端低聚域、组蛋白结合中间域和C端核酸结合域3个功能结构域。其中，N端低聚域涉及分子伴侣活性和核输出信号。NPM核仁定位信号区域在C端，NPM在调节中心体复制和核糖体生物合成等方面具有重要作用，其过表达可导致p53、MDM2(mouse double minute 2 homolog)和p21蛋白表达上调。急性髓系白血病的发生发展与NPM异常突变密切相关。NPM通过染色体易位、促进相关癌基因表达和异常的细胞质定位而诱发急性髓系白血病[26]。NPM-RARα融合基因是由t(5; 17)(q35; q21)易位形成，其保留了NPM的二聚体形成区和DNA连接区，RARα保留了配体结合区、DNA连接区和二聚体形成区。NPM-RARα形成二聚体结合视黄酸反应元件，从而竞争抑制野生型RARα功能，使造血细胞分化阻滞在未成熟阶段[27]。

2.3NuMA-RARα融合基因 NuMA基因位于第11号染色体长臂1区3带，全长77.7 kb。其在哺乳动物细胞中表达丰度较高，能编码分子量约为240 000的蛋白质。NuMA主要包含一个球形头部N端，中间为非连续卷曲和一个球形尾部C端。NuMA是一些自身免疫患者的自身抗原，其过表达会诱导多极纺锤体形成，引起细胞分裂异常[28]。NuMA功能涉及细胞周期调控、细胞凋亡、细胞分裂、胚胎移植和肿瘤发生等。在APL细胞中，t(11; 17)(q13; q21)易位导致NuMA与RARα形成融合基因。NuMA-RARα融合蛋白能与RXR相互作用形成异二聚体，竞争抑制野生型RARα功能[29]。

2.4STAT5B-RARα融合基因 STAT5B基因位于第17号染色体长臂1区1带2亚带，由19个外显子组成，在造血细胞生长、增殖、分化和凋亡过程中发挥重要作用。STAT5B-RARα融合基因是由RARα的3号外显子与STAT5B的15外显子融合，保留了部分RARα的反式激活域和STAT5B的酪氨酸活化结构域[30]。STAT5B-RARα融合基因竞争性结合RXR和酪氨酸激酶受体，干扰RARα和STAT信号转导，形成异常的转录因子调控造血系统。STAT5B-RARα融合基因阳性APL表现为视黄酸及亚砷酸耐药[31]。

2.5cAMP依赖性蛋白激酶Ⅰα调节亚基(cAMP-dependent protein kinase type Ⅰ-alpha regulatory subunit, PRKAR1A)-RARα融合基因 PRKAR1A基因位于第17号常染色体长臂2区4带2亚带，总长约130 kb，含有11个外显子，其中10个外显子存在编码区，编码区域长1 143 bp。PRKAR1A广泛表达于全身各个组织，是蛋白激酶A的重要调节亚基，它能负性调节蛋白激酶A活性。PRKAR1A是一个抑癌基因，其突变或表达下调会导致多种肿瘤的发生[32]。PRKAR1A-RARα融合蛋白可竞争性结合RXR，阻断核内环腺苷酸/蛋白激酶A信号转导通路，阻止粒细胞分化为成熟粒细胞[33]。

2.6FIP1L1(factor interacting with PAPOLA and CPSF1)-RARα融合基因 FIP1L1基因位于第4号染色体上，含有19个外显子。FIP1L1是一个完整的剪切亚基和聚腺苷酸化因子，其可与多聚腺苷酸聚合酶相互作用诱导多腺苷酸化。目前，FIP1L1基因通常与血小板衍生生长因子受体融合，激活酪氨酸激酶，进而促进嗜酸粒细胞增殖[34]。FIP1L1第15个外显子与RARα的第3个外显子结合形成FIP1L1-RARα融合基因，其二聚体可竞争性结合RXR，导致APL病理过程的发生[35]。

2.7B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(B-cell lymphoma 6 co-repressor，BCOR)-RARα融合基因 BCOR基因位于X染色体短臂1区1带4亚带，含有19个外显子，是肿瘤抑制基因。BCOR蛋白选择性与原癌蛋白Bcl-6的POZ结构域结合，是Bcl-6的共抑制因子。组织特异性Ⅰ类和Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶与BCOR相互作用，抑制组蛋白去乙酰化酶下游基因转录[36]。t(X; 17)(p11; q12)易位形成的BCOR-RARα融合基因，易与RXR形成BCOR-RARα/RXRα复合体，此复合体可竞争性与视黄酸反应元件结合降低视黄酸的转录活性[37]。

2.8寡核苷酸结合折叠区2A(oligonucleotide binding fold containing 2A, OBFC2A)-RARα融合基因 OBFC2A基因位于第2号染色体长臂3区2带3亚带，编码人单链DNA结合蛋白2。而单链DNA结合蛋白2在DNA损伤反应和基因组稳定性中具有重要作用。OBFC2A的第5外显子与RARα的第3外显子融合形成OBFC2A-RARα融合基因。其中，OBFC2A编码结合蛋白SOSS异源三聚体的支链，通过DNA损伤反应通路保持基因组稳定。另外，PML也通过同源重组支持DNA双链断裂的修复。OBF2CA蛋白有一个N端寡核苷酸结合褶能结合单链DNA底物，结合褶连接一个不饱和富含甘氨酸的尾区。在大多数情况下，这个尾区在融合蛋白中删除，但结合褶保留。因此，OBFC2A与RARα可能形成二聚体融合蛋白[38]。OBFC2A-RARα二聚体竞争性与视黄酸反应元件结合促使APL形成[39]。

2.9转导素β样1X连锁受体1(transducin β-like 1X-linked receptor 1, TBLR1)-RARα融合基因 TBLR1基因位于第3号染色体长臂2区6带，从酵母到人TBLR1均具有相似的结构和功能，是一个结构和功能保守的基因，含有16个外显子。TBLR1的信使RNA长度为1 548 bp，编码514个氨基酸的蛋白质。TBLR1蛋白包含3个结构域，包括C端的WD40重复结构域、N端的LiSH及一个F-box结构域。WD40结构域具有形成β-螺旋结构的功能，可为蛋白质之间相互作用提供支架。LiSH对半衰期和亚细胞定位有重要作用。F-box结构域具有募集泛素/19S蛋白酶体复合物的作用，从而介导转录抑制复合物和转录激活复合物之间的转换。TBLR1参与Wnt信号通路、Notch信号通路、核因子κB信号通路。其第5外显子与RARα的第3外显子融合形成TBLR1-RARα融合基因[40]。TBLR1-RARα融合蛋白可通过募集更多的NCoR/SMRT转录抑制复合物，减弱RARα介导的靶基因转录激活作用，TBLR1-RARα对视黄酸敏感，其机制可能与全反式视黄酸降解TBLR1-RARα融合蛋白有关[41]。

2.10GTF2H2(general transcription factor Ⅱ H subunit 2)-RARα融合基因 GTF2H2基因位于第7号染色体长臂1区1带2亚带3次亚带区域，由细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶和核心TF2H组成。细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶由3个亚基组成，主要作用为磷酸化RNA PolⅡ大亚基的C端结构域参与信使RNA的转录。核心TF2H由7个亚基组成。其中，着色性干皮病B组和着色性干皮病D组亚基通过核苷酸切除修复变形受损的双螺旋，在TF2H参与的各种调控机制中起关键作用。TF2H结构高度保守，其对信使RNA转录的调控是通过参与RNA PolⅡ大亚基C端结构域的动态磷酸化而实现。TF2H在转录的起始、延伸、终止中具有重要作用。在细胞周期进程中，细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶也发挥重要作用，是癌症治疗的新靶点[42]。GTF2H2-RARα融合基因是由t(7; 17)(q11; q21)易位形成。GTF2H2-RARα通过二聚体对RARα/RXR起负显性抑制作用，其介导的GTF2I信号通路抑制是APL发病的机制之一。GTF2I-RARα阳性APL对视黄酸不敏感[43]。

2.11干扰素调节因子2结合蛋白2(interferon regulatory factor 2 binding protein 2, IRF2BP2)-RARα融合基 IRF2BP2基因位于第1号染色体长臂2带3亚带，IRF2BP2蛋白由571个氨基酸构成。IRF2BP2蛋白包含C端指环结构域和氨基端锌指结构域两个结构域，其中指环结构域包括一些转录共抑制因子，充当E2和E3泛素连接酶的桥梁，在介导蛋白与蛋白之间起重要作用。锌指结构域主要存在于蛋白质的DNA结合结构域，与靶基因启动子结合。IRF2BP2是p53的靶基因，作为p53的转录共抑制因子，IRF2BP2对p53的下游分子Bcl-2相关X蛋白具有抑制作用。其能在转录水平抑制造血主要调节因子LIM结构域结合蛋白1复合物，因此能对红细胞的分化起调节作用[44]。IRF2BP2蛋白对活化的T细胞核因子具有抑制作用，进而调节细胞周期、分化、凋亡相关基因的表达。IRF2BP2-RARα融合基因由t(1; 17)(q42; q21)易位形成，通过负显性抑制而诱导APL发生。IRF2BP2-RARα融合基因阳性APL对视黄酸和砷剂敏感[45]。

3 小 结

19～20世纪，肿瘤根治术和将化学治疗整合于根治术(辅助化疗)是恶性肿瘤治疗出现的两次飞跃，而分子靶向治疗在肿瘤治疗中具有里程碑和革命性的意义。APL是针对肿瘤特异性生物学行为治疗而治愈的第一种人类恶性肿瘤，APL相关融合基因在其发生、发展及治疗中发挥极为重要的作用。PML-RARα融合基因的发现极大地提髙了对APL发病分子生物学机制的认识。目前，对APL的研究多与PML-RARα相关，且PML-RARα的特殊结构也使以其为靶标的全反式视黄酸和三氧化二砷成为临床上最常用的两个有效药物。砷剂和全反式视黄酸分别靶向PML-RARα导致PML和RARα降解，使APL治愈。未来，应更深入地了解APL相关融合基因的发生和功能机制，以更好地诱导其降解。