脑梗死患者外周血调节性B细胞水平及其与颈动脉粥样硬化严重程度的相关性

曾佩 袁江 王云甫

脑血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)作为神经系统的常见病及多发病，是目前导致人类死亡的三大主要疾病之一，其中脑梗死是最常见的脑血管疾病类型，脑动脉粥样硬化是脑梗死发病的基本病因[1-3]。有研究结果显示炎性反应参与动脉粥样硬化性疾病发生和发展中的绝大多数环节[4-5]。调节性B细胞(Bregs)是一种具有免疫抑制功能的B淋巴细胞亚群，在维持机体免疫平衡中具有重要的调节作用[6-8]。Bregs功能丧失或其在外周血中比例变化均将导致机体免疫平衡破坏，从而发生免疫炎性反应[8]。研究表明，Bregs可抑制动脉粥样硬化性脑梗死中的炎性反应而发挥保护作用[9-11]。目前，有关Bregs与炎性疾病发病机制以及治疗的关系成为研究热点。然而，有关Bregs在脑血管疾病中的作用研究并不多。本研究观察了动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血Bregs水平变化及其与颈动脉粥样硬化严重程度的相关性，旨在为免疫治疗在脑血管疾病中的应用开辟新的途径。

1 对象和方法

1.1对象收集2017-09-01—2018-05-01十堰市太和医院神经内科收治的动脉粥样硬化性脑梗死患者50例，其中男25例，女25例，平均年龄(63.50±9.25)岁。纳入标准：(1)年龄>45岁且<80岁，男女不限；(2)符合全国第四届脑血管病学术会议修订的急性脑梗死的诊断标准，经病史和影像学检查证实；(3)病程在1周以内。排除标准：(1)近3个月内发生急性心脑血管疾病者；(2)近3个月服用过非甾体类抗炎药、免疫抑制剂、类固醇等可影响外周血CD19+CD5+CD1d+Bregs细胞水平的药物；(3)近1个月内发生感染性疾病者；(4)合并代谢性疾病和重要器官功能不全者；(5)合并神经精神类疾病者。另选择同期入院进行健康体检者50名作为对照组，其中男25名，女25名，平均年龄(62.36±8.95)岁。入组对照者行颅脑CT或颅脑MRI检查排除脑血管疾病，行颅多普勒超声(TCD)检查排除颅内、外血管狭窄或闭塞，其他排除标准同脑梗死患者组。所有入组对象均签署知情同意书。

1.2主要试剂和仪器Ficoll分离试剂购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；B Cell Isolation Kit Ⅱ human 购自Miltenyi Biotec 公司；MS column、miniMACS separator购自于Miltenyi Biotec公司；人白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒、人转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA试剂盒购自欣博盛生物公司；鼠抗人CD19-APC抗体、鼠抗人CD5-FITC抗体、鼠抗人CD1d-PE抗体购自BD Biosciences公司；MACS Beffer购自Miltenyi Biotec公司；RPMI 1640 Medium细胞培养基、Gibco胎牛血清(FBS)购自HyClone公司。

1.3方法

1.3.1颈动脉粥样硬化程度评估：采用TCD测量评估患者颈部血管粥样硬化情况。正常：颈动脉内-中膜厚度<1.0 mm，颈内动脉增厚：1.0 mm≤颈动脉内-中膜厚度<1.2 mm，颈动脉斑块形成：1.2 mm≤颈动脉内-中膜厚度<1.4 mm，颈动脉狭窄：颈动脉内-中膜厚度≥1.4 mm。

1.3.2外周血单个核细胞(PMBC)的提取：入院当天(对照组体检当天)取外周血，采用密度梯度离心法(Ficoll法)提取外周血PMBC，将细胞水平定量在(3～4)×107个/mL，与5 mL细胞培养液(由90%细胞培养基+10% FBS+500 μL双抗混合而成)混匀后置于培养瓶中培养1周。

1.3.3B淋巴细胞的分选及CD19+CD5+CD1d+Bregs的鉴定：将培养好的PBMC离心、洗涤、去上清，选用免疫磁珠分选系统(MACS)，按说明书所示流程得到B淋巴细胞。将B淋巴细胞制成悬液，与5 mL细胞培养液共培养1周，离心取其上清备用于ELISA实验。将离心后所得B细胞用适量的Buffer液重悬，分别加入鼠抗人CD19-APC抗体、鼠抗人CD5-FITC抗体、鼠抗人CD1d-PE抗体，一定时间孵育后采用流式细胞术检测各组CD19+CD5+CD1d+Bregs比例。上述操作均于无菌环境下进行。

1.3.4IL-10和TGF-β1水平检测：采用ELISA方法检测外周血IL-10和TGF-β1水平。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。将处理得到的96孔板用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度〔D(λ)〕值。标准品及样品均设置有复孔，取两孔的平均D(λ)值并减除空白孔平均D(λ)值，以标准品浓度为横坐标，D(λ)值为纵坐标绘制出标准曲线，根据标准曲线计算样品浓度。

1.4统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计学分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两样本均数间进行比较采用独立样本t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1两组Bregs水平比较脑梗死患者外周血Bregs比例明显低于对照组(P<0.05)，其分泌的细胞因子IL-10、TGF-β1水平也较对照组明显降低(P<0.05)。结果见图1、表1。

2.2不同程度颈动脉粥样硬化患者外周血Bregs水平比较颈动脉狭窄组外周血Bregs水平及IL-10、TGF-β1水平低于颈动脉内膜增厚组和颈动脉内膜斑块组(P<0.05)，颈动脉内膜斑块组外周血Bregs水平及IL-10、TGF-β1水平低于颈动脉内膜增厚组(P<0.05)。结果见表2。

注：Bregs：调节性B细胞，表1、表2同；A：前向散射光(FSC)测量细胞大小，侧向散射光(SCC)测量被抗体染色的细胞荧光强度，圈中所示为单核细胞中的B细胞；B：以A图所圈B细胞设门，找出CD5+细胞(P2)，余为CD5-细胞；C：以B图中CD5+ B细胞设门，找出CD19+CD1d+ B细胞，Q2区即为Bregs，其表型为CD19+CD5+CD1d+ 图1 两组外周血CD19+CD5+CD1d+ Bregs水平(流式细胞术法)

表1 两组外周血Bregs及细胞因子水平比较

注：IL-10：白细胞介素10，TGF-β1：转化生长因子-β1；表2同

注：与增厚组和斑块组比较，aP<0.05；与增厚组比较，bP<0.05

3 讨论

脑梗死约占全部脑血管病的70%[12]，又称为缺血性脑卒中，具有高发病、高致残率、高死亡率、高复发率等特点，给社会和家庭带来沉重负担。因此，明确脑梗死的危险因素、筛选高危人群、早期干预从而降低脑梗死发生率显得尤为重要。目前脑梗死的一般治疗主要集中在抗血小板聚集、降血脂、控制血管高危因素(高血压、糖尿病、房颤等)等[13-14]。大量研究结果显示，脑动脉粥样硬化是系统动脉粥样硬化的一部分，其发病机制、病理改变、复合损伤与进展均符合慢性炎性改变，易损伤的脑血管部位也均为血流动力学改变的部位，一旦脑卒中发生，炎性反应参与脑组织的病理损伤过程[15-16]。脑动脉粥样硬化是一种慢性炎性反应介导的疾病，其对中枢神经系统的损伤不仅与其导致的缺血有关，可能还包括了炎性反应过程的启动[17-18]。目前，有关免疫治疗是否可用于脑梗死的治疗以及如何应用的研究尚不多。有研究表明，体液免疫中的Bregs可分泌相关细胞因子抑制动脉粥样硬化性脑梗死中的炎性反应，进而发挥脑保护作用[19-20]。因此，本研究通过观察动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血Bregs水平及其与颈动脉粥样硬化严重程度的关系，旨在初步探讨体液免疫在脑梗死中的作用。

本研究结果显示，脑梗死患者外周血Bregs水平及其分泌的IL-10、TGF-β1细胞因子水平均较对照组降低，提示脑梗死患者外周血Bregs数量及功能降低，表明体液免疫异常可能与脑梗死的发生有关。由此推测，临床上可能通过监测脑卒中高危人群外周血Bregs水平预测脑卒中的发生概率，进而提前进行相关干预，降低脑卒中的发生；另一方面，对脑卒中患者在改善循环、抗血小板聚集、降脂等常规治疗的基础上加用免疫相关治疗可能使患者受益。但Bregs水平与脑卒中的确切关系以及疫治疗在脑卒中的疗效还有待进一步研究。

动脉粥样硬化是脑梗死发病的最主要原因，本研究通过比较脑梗死患者不同程度颈动脉粥样硬化者间外周血Bregs水平发现，随颈动脉粥样硬化程度加重，患者外周血Bregs水平及IL-10、TGF-β1水平逐渐降低，提示Bregs水平与动脉粥样硬化性脑梗死患者颈动脉粥样硬化严重程度密切相关，由此推测，通过测定脑梗死患者外周血Bregs水平可能用于评估患者的血管病变情况。

综上所述，本研究结果显示，动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血Bregs数量及IL-10、TGF-β1水平较对照组减少，且其Bregs水平与动脉粥样硬化的程度密切相关，提示动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血Bregs功能出现一定程度丧失，Bregs异常参与了动脉粥样硬化性脑梗死的发病。