超声微泡在心血管疾病诊治中的应用进展

郑晓东，李 珊，刘映峰，缪 绯

(南方医科大学珠江医院心血管内科，广州510280)

近年来，全球心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的发病率及死亡率逐年上升，尽管各种预防措施、诊断方法和治疗手段均取得了实质性进展，但CVD在北美仍是发病率和死亡率最高的疾病之一[1]。近年来我国CVD的发病率也逐年升高[2]。因此学者们期待有更多的方法和技术对当前CVD的诊治进行补充，其中包括超声微泡技术。

超声微泡技术是一种无创、具有组织特异性的新技术，其以超声微泡作为媒介，在超声下实时显影靶器官。超声微泡的微泡是由外壳包裹惰性气体构成，常见的外壳包括蛋白质、脂类以及高分子聚合物，大小为1～8 μm[3]。微泡经外周静脉到达特定器官后，在超声辐照下呈非线性的反射信号，具有比普通超声更佳的分辨率和对比度，尤其是对于肺气肿、肋间隙狭窄、肥胖等声学显影不佳的疾病，超声微泡的显影优势更为明显。第3代超声微泡具有不易透过组织间隙、无肝肾毒性、在血液中稳定存在等优势，具有良好的生物安全性和临床应用价值[4]。对微泡表面进行特定抗原或配体修饰后制备成靶向微泡，在靶向超声成像技术支持下，可以在细胞水平和分子水平分析活体组织的生物过程，能够对疾病发生发展中的重要分子和转导途径间接成像，为早期诊断和治疗疾病提供新的方法[5-6]。现就超声微泡在CVD诊断和治疗中的应用现状进行综述。

1 超声微泡在高血压肾损伤诊治中的应用

长期高血压是导致肾动脉粥样硬化的主要原因，肾动脉粥样硬化可发展为高血压性肾损伤。血清尿素氮、血肌酐只有在肾小球滤过率下降1/3～2/3时才明显升高，而尿蛋白阳性能反映早期高血压肾功能损伤，但上述方法均无法评估单个肾脏的功能，而且对诊断高血压肾损伤存在一定的滞后性，而超声微泡检查可以克服这些局限性[7]。杨荣和李明星[8]发现，在评估窒息新生儿早期肾功能损伤中，超声微泡测得的肾血流动力学参数的敏感性及有效性均优于尿素氮和血肌酐，并能评估单个肾脏的灌注情况。在动物实验方面，朱向明等[9]的研究表明，超声微泡可对自发性高血压大鼠的早期肾功能损伤进行定量评估。Le Dorze等[7]发现，超声微泡可较实验室指标更早发现早期高血压肾功能损伤的肾实质灌注异常和肾动脉硬化程度。在治疗方面，对已经发生高血压肾损伤的患者，超声微泡可以评估肾功能损伤的程度，定期随访可动态监测疾病进展，为临床治疗提供参考[10-11]。目前已有报道将携带基因的靶向微泡，通过微泡破坏技术将基因定向释放于靶组织，从而在基因水平治疗及预防肾功能不全[12]。超声微泡技术可实现在分子和基因水平治疗高血压肾功能不全。

2 超声微泡在心力衰竭诊治中的应用

普通超声对于评估存在肺气肿、肥胖、肋间隙狭窄、胸腔或心包内置管的患者的心功能有一定的局限性[13]，超声微泡检查一定程度上可以优化此类患者的心功能评估。Tomaszuk-Kazberuk等[14]对30例冠状动脉旁路移植术后进行普通超声和超声微泡检查的患者进行比较，结果发现，在心脏510个节段中，普通超声有217个节段显影不清，而超声微泡检查仅有4个节段显影不佳，因此超声微泡检查能清晰显示更多心脏节段。Larsson等[15]采用普通超声和超声微泡检查患者左心室射血分数和左心室容积发现，在普通超声检查中，不同超声医师之间得出的结果存在显著差异，而采用超声微泡检查这种差异性明显降低，提示超声微泡检查可以减少超声医师主观偏倚造成的结果差异。皮淑芳等[16]报道了1例因肥胖导致透声条件差的心力衰竭患者，超声微泡检查显示心肌致密化不全，左心室侧壁及心尖部肌小梁粗大，深陷隐窝内可见微泡填充，致密层和非致密层分界清楚。相对于普通超声，超声微泡检查在心功能诊断中具有更高的敏感性和准确性[17]。

在心力衰竭治疗方面，动物实验发现，一定强度的超声辐照或可对心肌产生正性肌力作用[17-19]。Forester等[20]研究不同强度的超声对离体大鼠乳头肌收缩功能的影响发现，0.25～2.0 W/cm2的超声强度可明显增强大鼠乳头肌的收缩。Hanawa等[19]对猪左心室射血分数减低的慢性心肌缺血模型进行研究发现，低强度超声(193 mW/cm2)辐照治疗8周后，治疗组左心室射血分数较对照组明显升高(P<0.05)，但过强的超声强度可导致不良的生物学效应，甚至导致细胞死亡。如果能确定有效且安全的超声强度以诱导心肌正性肌力效应，将是心力衰竭无创治疗的重要突破[17]。

3 超声微泡在急性冠状动脉综合征诊治中的应用

3.1超声微泡对急性心肌缺血的评估 目前临床上评估急性心肌缺血的方法包括心电图、心肌损伤标志物的动态演变、心脏放射性核素检查、心脏磁共振、冠状动脉造影检查、超声微泡等，其中超声微泡具有床旁检查及时性和实时性等优点。在缺血炎症反应中，P选择素可在几分钟内迅速表达并可持续数小时，随后细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)也大量表达，因此P选择素和ICAM-1是评价早期心肌缺血的理想指标[21-22]。有学者成功构建了携带P选择素的靶向超声微泡，并成功用于评估小鼠心肌缺血再灌注后的炎症反应，可间接判断心肌缺血的范围[23]。纪丽景等[22]利用P选择素单抗靶向微泡评估小鼠心肌缺血再灌注损伤，结果显示，靶向微泡在缺血心肌中的黏附率较小静脉提高了10倍，缺血心肌中靶向微泡的显影效果较普通微泡提高了4倍。有研究表明，装载ICAM-1的靶向微泡对缺血的炎症组织有较高的检出率，可用于缺血再灌注心肌的诊断[24-26]。对超声微泡进行特异性抗体或配体的修饰，可以提高缺血心肌的检出率，如果能在微泡中包裹治疗的药物或基因，使其在微泡靶向结合的基础上定向释放药物，或可实现缺血心肌的精准治疗[25]。

在评估冠状动脉血流方面，超声微泡可以精确测量微循环血流，具有无放射性、无创、相对简便等优点。Gaibazz等[27]评估了400例超声负荷试验患者的冠状动脉情况发现，狭窄程度>50%的患者中，超声微泡造影具有较高的灵敏度(96%)和准确度(86%)。Senior等[28]比较了516例冠心病患者的超声微泡检查和单光子发射断层扫描显示，超声微泡检查具有更高的敏感性。超声微泡检查用于急诊胸痛的鉴别诊断时，或可减少不必要的住院和侵入性心脏检查[29]。20世纪90年代已有学者发现，低频高强度超声有扩张冠状动脉的作用[30]。在此基础上，Miyamoto等[31]使用低频高强度超声(27 kHz，1.4 W/cm2)经胸辐照犬的冠状动脉，5 min后行冠状动脉造影及血管内超检查发现，冠状动脉管径较前扩大，并与冠状动脉内灌注硝酸甘油的效果相当。超声辐照结束1 h后检查发现，冠状动脉管径恢复，这表明超声的扩张冠状动脉的作用是可逆的[31]。这或可成为一种潜在的治疗急性冠状动脉综合征的方法，在血运重建前扩张冠状动脉并改善心肌缺血。

3.2超声微泡在冠状动脉血栓诊治中的应用 血栓形成是急性冠状动脉综合征的常见原因，靶向超声微泡可以实现无创血栓显影。在超声微泡表面组装血栓形成过程中关键分子的抗体或配体，使微泡与血栓靶向结合可实现超声下血栓显影。国外有学者构建了携带有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的超声微泡，其能与血栓中的ⅡbⅢa受体特异性结合，在体内外均能增强血栓显影，在诊断急性冠状动脉综合征血栓病变中具有重要价值[32-33]。在靶向微泡特异性结合血栓的基础上，一定强度的超声辐照产生的空化效应可使血栓软化甚至溶解[34]。也有学者在靶向微泡中包裹溶栓药物，定向爆破微泡释放药物可增加溶栓效果，提升心肌灌注、改善心功能[30,35]。Xie等[36]用猪冠状动脉血栓栓塞模型进行超声溶栓实验，结果显示，在心外膜血管未恢复时，超声微泡溶栓仍可有效增加心肌供血，明显减少心肌梗死面积。提示超声微泡溶栓可促进微循环开放，为解决急性冠状动脉综合征治疗过程中的无复流及慢血流提供新思路。

4 超声微泡在心肌干细胞移植中的应用

梗死心肌不能再生是目前心肌梗死后治疗的一大难题。干细胞移植治疗心肌梗死的前景日益广阔，目前认为骨髓间充质干细胞是心肌梗死再生治疗的理想细胞，但由于心肌梗死后的缺血损伤、再灌注损伤、炎性因子过度表达、氧化应激、神经内分泌激活等导致心肌梗死后干细胞移植存活及分化率较低，不能满足临床需求。超声微泡技术的出现有望提高心肌干细胞移植的成功率[37]。国内研究证实，超声微泡处理能促进干细胞向心肌缺血区域归巢，促进毛细血管生成，改善心肌梗死后的心功能[38]。Song等[39]报道，经超声微泡破坏技术处理大鼠梗死心肌后，电镜下可见血管内皮细胞间隙增宽、微血管破裂，提示微泡破坏技术可优化移植微环境，进一步研究发现，超声微泡技术处理后分化细胞明显增多，内皮细胞和平滑肌细胞形成的新生毛细血管的密度明显增加，提示微泡破坏技术可提高移植后细胞的成活率和分化率[39]。Ling等[37]以犬为研究对象，利用不同参数靶向微泡破坏预处理梗死心肌，经冠状动脉注射间充质干细胞，结果显示，该方法增强了干细胞治疗心肌梗死的效果，有效改善了心功能，同时得出了一组相对较佳的超声辐照参数：频率为1 Hz，脉冲超声强度为1 W/cm2。但超过一定强度的超声辐照可促使心肌细胞凋亡，因此寻找合适强度的超声微泡改善移植微环境，或可提高心肌梗死干细胞移植治疗的成功率。

5 超声微泡介导基因转染的应用

基因治疗是将外源性基因导入靶细胞，纠正或补偿基因缺陷引起的疾病，从而达到治疗目的。基因治疗能从分子水平调整细胞功能，使其成为预防和治疗CVD的一个具有前景的有力措施。超声靶向微泡破坏是指利用超声和携带靶基因的微泡实现基因转染，是目前基因转染研究的热点。靶向微泡的声孔效应和空化效应能够提高细胞膜的通透性，从而提高基因转染的有效率。与传统病毒载体相比，靶向超声微泡能够增加基因转染的特异性和成功率，且具有低免疫原性、低费用以及低系统毒性等特点。Fujii等[40]研究了超声微泡介导的基因转染在大鼠心肌梗死模型中的治疗效果，结果提示，重复使用超声微泡介导基因转染能有效增加新生血管数量，减少心肌梗死面积，改善左心室功能。证实质粒DNA能通过反复超声微泡介导延长基因寿命。苏强[41]的研究表明，超声微泡靶向转染技术能够成功转染微RNA-21至心肌细胞中，实现转染基因的有效表达，并通过抑制程序性细胞死亡因子4/核因子κB/肿瘤坏死因子α信号转导通路，减少心肌炎症反应以改善心脏功能。Liu等[42]已成功构建了靶向超声微泡破坏的微RNA-21质粒，并在猪冠状动脉微栓塞模型中证实，该质粒转染基因后能显著降低凋亡相关蛋白4抗体的表达与核因子κB的活性，提高了心脏功能。超声微泡破坏技术介导基因转染是治疗CVD的一种无创、安全、高效的方法[40]。

6 展望和不足

随着对超声微泡技术研究的深入，其在CVD诊治中的优势也显示出来，靶向微泡技术诊断疾病的敏感性和特异性均更高，体现了精准医疗的理念[12]。超声微泡技术除在高血压肾损伤、心力衰竭、急性冠状动脉综合征等疾病的诊治中有实质性进展外，在其他CVD中也有可观的发展前景。Hanawa等[19]的研究表明，超声微泡辐照可有效抑制血管内皮增生，诱导平滑肌细胞凋亡，并可无创、有效地改善介入术后支架内的再狭窄。Hersch和Adam[43]发现，结合正压和负压脉冲超声辐照大鼠心脏，记录到室性早搏的发生率为70%，提示超声辐照有潜能成为体外起搏和除颤的新方法。

目前超声微泡技术诊治CVD大多处于基础研究阶段，仍存在许多亟待解决的问题：①目前大部分疾病的靶向分子尚未明确，需要研究制备更加特异性的靶向超声微泡，以降低对非目标器官的影响；②尽管在动物研究中靶向超声微泡获得了一些积极成果，但微泡与细胞的作用机制、具体治疗方案等仍需解决；③目前微泡制备技术仍需改善，超声微泡在体内的稳定性，特别是修饰后装载药物或基因的稳定性仍需进一步提高；④过强的超声辐照会引起心肌微血管渗漏、破裂，甚至炎性细胞浸润，心肌细胞损伤等不良反应；不合适的超声辐照又无法诱发微泡破坏释放药物，降低基因转染率等。因此寻找安全有效的超声阈值迫在眉睫。总之，随着超声微泡技术的日益发展，相信能研制出稳定性更好、靶向性更强、治疗效果更佳的超声微泡以满足临床需要，为CVD的诊疗带来更多希望。