软骨细胞能量代谢的瓦氏效应和Crabtree效应

张宇标，李皓桓

(武汉大学人民医院骨外科，武汉 430060)

关节软骨覆盖在大部分活动关节的滑膜面，是骨骼的重要结构之一，其表面光滑、富有弹性接近无摩擦，保证了关节的光滑[1]。关节软骨不仅能在关节运动时减少关节之间的摩擦力，同时也能分散承重压力，保护软骨下骨组织[2]。关节软骨无神经和血管，营养主要由滑液和关节囊滑膜层周围的动脉分支供应。一旦出现损伤，自身无法修复[3]。软骨细胞是关节软骨中唯一存在的细胞，占关节软骨体积的2%～10%，其余为软骨外基质(主要成分为Ⅱ型胶原和蛋白聚糖)。在胶原纤维之间，散在分布着软骨细胞，软骨细胞由浅层向深层逐渐由扁平样至椭圆或圆形的细胞组成，软骨细胞通过酶降解和基质分泌来调节细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的稳态，这些软骨细胞的能量代谢维持关节软骨的正常组织代谢，一旦软骨细胞的能量代谢平衡被打破，将严重影响关节软骨的正常功能[4]。目前研究者对软骨细胞的能量代谢方面研究尚不深入，现对软骨细胞能量代谢的瓦氏效应和Crabtree效应研究进展进行综述。

1 关节软骨的构成及生理特点

1.1软骨组织的构成及其各层次的生理特点 软骨是由水(60%～85%)、ECM和软骨细胞组成的无血管和神经组织[4-5]。ECM主要由胶原蛋白和蛋白聚糖聚集体组成[1]，其中Ⅱ型胶原占ECM中胶原蛋白的90%～95%，并形成与蛋白多糖聚集体交织的纤维。ECM中的第二大类分子是蛋白聚糖，蛋白聚糖与透明质酸相互作用形成蛋白聚糖聚集体。这种复合物维持了软骨可压缩、可拉伸和耐摩擦的特性，使其能够在狭窄的关节环境中生存和发挥自身作用[6-7]。其他ECM成分包括软骨寡聚蛋白、软骨连接蛋白、透明质酸等。宏观上，关节软骨是多层次的异向性和异质性组织，可以分成表层区、中层区、深层区3部分。每个区域之间ECM结构、软骨细胞表型和细胞形状不同，同时作用也不同[8]。表层区的Ⅱ型胶原纤维与关节表面平行排列，可以抵抗由关节连接产生的关节面的剪切力。在软骨表面区域，软骨细胞尚未发育完全，体型小呈扁椭圆形，细胞长轴与软骨表面平行，多为单个存在，细胞密度最大[9]。在软骨的中央，软骨细胞成群分布，每群2～8个细胞，这些细胞均由一个软骨细胞分裂而来，故称同源细胞群，电镜下，软骨细胞表面有许多小突起，胞质内有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体以及少量糖原和脂滴。40%～60%的中层区软骨含有随机排列的Ⅱ型胶原纤维和圆形软骨细胞；在关节软骨深层区，胶原纤维垂直于关节面排列。蛋白多糖含量从浅层到深层增加，而水化作用则由浅层到深层减少。

1.2软骨细胞特点及其同能量代谢的相关匹配因素 关节软骨中与ECM相比，软骨细胞数量少、体积小，增殖和代谢能力低[10]。软骨中含有高浓度乳酸和糖酵解代谢的各种酶，含氧低，能量来源于厌氧代谢途径。软骨下的骨皮质中分布有许多的微动脉、微静脉和神经分支,一直延伸到软骨下的钙化软骨层,营养深层软骨。但维持软骨细胞正常生理活动的营养物质绝大部分是通过关节液渗透，经基质弥散来营养软骨细胞[11]。各种营养物质经过软骨基质的弥散系数只有水的一半，这种弥散是一种被动过程，即在滑液流动时，软骨能得到充分营养，而在关节制动时滑液停滞，分子弥散阻力增加，深部软骨细胞营养获得减少。所以在关节反复负载的情况下，才能保持正常软骨的代谢。同时，软骨下骨组织所分泌的营养物质，也能经弥散透过钙化软骨区向深层区的细胞提供能量[12]。软骨组织中氧含量极低[11,13-14]，表层区稍高，为5%～10%，深层区可低至1%，而动脉血中的氧含量高达13%[15]，所以软骨细胞内化和血管形成的固有缺陷阻止成人的关节软骨进行任何实质性的自我修复[8]。因此，有别于血供丰富的其他细胞，软骨细胞的内环境和能量代谢独具特点。

软骨无血管，滑液中氧含量相对较低和关节软骨厚度较高，环境氧气张力较低[10]。相比血氧供应充足的细胞(比如肝细胞)，软骨细胞内线粒体数量少[16]，而该特点恰能与关节部位的低氧、缺血内环境相适应。有报道软骨细胞生长最佳氧含量为5%[13]，在这一条件下，软骨细胞ATP合成量显著提高，其中绝大部分ATP通过糖酵解途径中的底物水平磷酸化合成[17-18]。

2 软骨细胞瓦氏效应

德国生理学家奥托·海因里希·瓦尔堡及其同事于20世纪20年代在肿瘤细胞中首先发现癌细胞在增殖过程中随着乳酸产量的增加而呼吸减少，即细胞增殖速度越快，乳酸生产速率越高，这表明癌细胞主要依靠发酵代谢来产生ATP[19]。即使在氧气较为充足的情况下，癌细胞也倾向于通过糖酵解而不是氧化磷酸化产生ATP[20]。这种代谢现象被称为有氧糖酵解或瓦氏效应[21]。软骨细胞的代谢在低氧条件下以糖酵解为主，但即使在高氧环境中(如21%氧含量，相对于软骨细胞为高氧)，这种代谢模式仍能维持。研究者通过对比关节软骨细胞在21%氧含量和低于1%氧含量下对外源性葡萄糖的摄入量及乳酸产量，发现这些细胞在21%氧含量下，绝大部分外源性葡萄糖仍然转化成为乳酸，而非进入氧化磷酸化途径，即所谓的“负巴斯德效应”[22]。同时他们发现，软骨细胞在体外培养时(即21%氧含量)利用线粒体进行氧化呼吸以生成ATP，但这仅占总ATP量的25%左右[22-23]。可以推测，余下的ATP应该通过糖酵解进行合成。

缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的表达是“瓦氏效应”发生的基础。HIF-1在低氧条件下稳定表达，能调控葡萄糖摄入、糖酵解相关酶的表达，维持低氧下细胞内环境的稳态。研究发现，HIF-1是促使细胞适应低氧环境的重要蛋白，是一种由HIF-1α和HIF-1β两个亚基共同组成异源二聚体。β亚基在细胞核内恒定表达，而α亚基存在于细胞质内，只在低氧下表达[24]。HIF-1α参与缺氧代谢组织(如关节软骨细胞)的低氧反应。在生长板中，发现HIF-1α是软骨细胞活力、代谢和基质产生所必需的。软骨细胞处在无血供的软骨基质中，构成了一个低氧、低糖的环境，所需的营养物质和氧来自关节液渗透或弥散。HIF-1是维持低氧环境下软骨细胞能量代谢稳态的重要蛋白[25]。在氧充足时(如21%氧含量)，HIF-1α发生羟基化。肿瘤抑制因子与羟基化HIF-1α连接之后被泛素化酶识别；最终，泛素化的HIF-1α在蛋白酶体和溶酶体的共同作用下发生降解。正常细胞内HIF-1α的半衰期很短(<5 min)，表达量极低，往往较难检测[24,26]，在低氧条件下，细胞内的辅氨酸羟化酶2，因缺乏氧这一催化因素，无法羟基化HIF-1α亚基上的两个辅氨酸残基，导致辅氨酸残基不能与肿瘤抑制因子上的丝氨酸和组氨酸形成氢键，HIF-1α也就无法泛素化，进而可在细胞质内稳定表达[26]。正常氧含量下，HIF-1α被细胞内的相关蛋白酶标记并且泛素化，随后水解，因此在通过三羧酸循环和氧化磷酸化偶联获取ATP的大部分细胞中，HIF-1α表达量极低，难以检测。但是在某些细胞中，如软骨细胞、髓核细胞、睾丸间质细胞和单核细胞，依然能表达并可检测到HIF-1α[27]。核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)同样能上调HIF-1α。NF-κB是细胞内的一大类蛋白家族，是重要的转录因子，负责调控数百种基因的表达。NF-κB家族包括NF-κB和Rel两个亚族，其成员分别为p50、p52和RelA、RelB、c-Rel，其共同特点是具有RHD结构域(Rel-homology domain)，此结构域不仅可以使NF-κB家族的不同蛋白互相结合、形成同源二聚体或者异源二聚体，同时也是NF-κB家族结合DNA的位点[28]。Rel亚族的C端具有转录激活结构域，能激活基因转录；NF-κB亚族必须与Rel亚族通过RHD结合才能获得转录基因的功能[28]。而且研究表明，氧浓度的高低不能影响NF-κB提高HIF-1α的转录和表达[29]，因此在低氧环境下的软骨同样存在NF-κB对HIF-1α的促进作用。活性氧类主要来源于线粒体，是细胞氧化呼吸过程中的副产物，包括超氧化物、羟自由基(·OH)、过氧化物(H2O2等)和单态氧等[30]。活性氧类是细胞内的重要信号分子，在HIF-1α缺氧条件下的调节作用机制复杂[25]。有研究表明，活性氧类不仅能维持细胞内的HIF-1α状态稳定[31]，还能通过激活NF-κB间接提高HIF-1α表达[32]。一氧化氮是维持细胞正常生理活动的重要物质，可通过抑制脯氨酰羟化酶结构域2的活性[33]使常氧下细胞内HIF-1α的降解减少[34-35]。同时一氧化氮和超氧化物之间的相互作用也介导HIF-1α调节。一方面，一氧化氮和超氧化物彼此反应产生多种能够硝化、亚硝化或氧化蛋白质的活性中间体。另一方面，超氧化物导致内源性一氧化氮介导的细胞信号转导和蛋白质的翻译后修饰减少，这些可变效应导致在一氧化氮和超氧化物存在下HIF-1α稳定性的差异调节[31]。

3 软骨细胞Crabtree效应

在高浓度葡萄糖的环境下，软骨细胞的氧摄入量处于抑制状态，细胞内氧化磷酸化效应降低，导致细胞更多地依赖糖酵解合成ATP、生成乳酸。高浓度葡萄糖抑制细胞氧化磷酸化的这个现象被称为Crabtree效应。尽管研究者已经提出了许多假设，但其触发机制仍未知。Crabtree效应的产生也可能是几个因素相互作用的结果[36]。目前为大多数研究者所接受的假设是两种糖酵解酶(磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶)和线粒体ATP酶对游离胞质ADP的影响[36-37]。如果糖酵解过度活跃，其理论上可以超越线粒体ADP摄取，由于线粒体摄取的ADP是氧化磷酸化底物之一，这将限制ATP合酶作用的其他底物，继而降低呼吸作用。不过因为线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶的米氏常数是糖酵解酶百分之一[38]，糖酵解超越线粒体ADP的摄取量不可能在体内发生，于是研究者得出结论，即使糖酵解酶增加糖酵解的活性，胞质ADP仍将通过线粒体来提供能量。糖酵解酶使用Mg2+-螯合的核苷酸作为底物，而线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶的实际底物是非螯合的核苷酸，因此糖酵解和线粒体之间游离ADP供能的最终竞争将取决于螯合和非螯合ADP之间的比例。如果ADP或呼吸道底物保留在细胞质中，则会导致呼吸通量下降。另一个提出的机制是线粒体外膜通过多孔通道的通透性调节膜和间质底物的接触，并以此来调节氧化磷酸化[39]。向对Crabtree效应敏感的细胞中加入外部葡萄糖会在几秒内触发氧气消耗的部分抑制，从而抑制基因表达和蛋白质的从头合成。来自全软骨厚度的软骨细胞在剥夺葡萄糖时表现出氧气消耗增强，与Crabtree现象一致[40]。软骨细胞存在的Crabtree效应能显著降低细胞的氧摄入量，以适应不同软骨层面的低氧环境，这可能是维持低氧低糖环境下软骨细胞能量代谢的稳态的重要途径[41]。通过对不同层面上的软骨细胞研究，研究者发现这些细胞的氧摄入量大小与其所处的层面相关[42]：浅层软骨细胞的氧摄入量比深层的细胞要少。Heywood小组做了更为详细的研究设计，将同等数量的软骨细胞分别暴露于低糖和高糖培养基下，同时检测两者的氧摄入量，发现在低糖环境下对氧的摄入量仍然显著高于高糖环境[43]，而且高糖能有效抑制软骨细胞的氧化磷酸化反应，由此确定体外培养的软骨细胞同样具有Crabtree效应。

4 小 结

软骨细胞在体内处于低氧、低糖的环境下，细胞质中的HIF-1α可以稳定表达，从而进入细胞核与HIF-1β组成HIF-1；HIF-1能干扰三羧酸循环，因此HIF-1可诱导软骨细胞在低氧低糖的环境中以糖酵解途径获取所需的ATP量，维持细胞稳态。当软骨细进入体外培养环境时，暴露在相对高浓度氧(21%)中，在一定时间内，仍可以维持细胞内HIF-1α的稳定性，所以软骨细胞存在瓦氏效应，Crabtree效应与瓦氏效应的表现一致，区别在于Crabtree效应是由于高浓度的葡萄糖导致的，进一步的研究中应纳入葡萄糖浓度这一因素，降低Crabtree效应对瓦氏效应的干扰，有助于更准确地探究软骨细胞的能量代谢与瓦氏效应和Crabtree效应的关系。同样也可以研究骨关节炎患者合并糖尿病是否存在Crabtree效应及其相互之间的关系。