膝关节骨性关节炎动物建模研究进展

张 晨，宋国瑞，刘子歌，陈德胜

(1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院骨科，银川 750004)

目前90%以上膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)病例临床确诊时已为中晚期，症状、体征明显，关节软骨退化严重，关节腔内周围组织病损多，且多数已不可逆[1]。现阶段，临床上治疗手段仍以手术为主，每年消耗了大量的社会、医疗和经济资源[2]。有专家提出，如果在KOA病变早期即能及时发现并进行干预治疗，则极有可能早期阻断KOA的软骨退行性变进程，甚至逆转退行性变进程，从而彻底改变目前KOA临床治疗的被动局面[3]。目前KOA常用的动物模型有诱导型动物模型、自发性动物模型、转基因型动物模型等。现介绍近年来成功建立KOA的建模方法，包括关节石膏制动法、Ilizarov外固定法、关节撞击法、关节腔内瘦素注射法、基因敲除法等，从诱导型动物模型、自发型动物模型、转基因型三大建模类型进行综述，对比各类建模方法的特点，以期对KOA的诊疗、研究有所指导。

1 诱导型动物模型

诱导型动物模型即通过生物、物理及化学因素作用于动物，使动物产生类似于人类的疾病改变。人为干预诱导KOA动物模型建立的一般方法，包括关节制动、关节撞击、关节内药物注入、手术方法等[4]。

1.1关节制动法 关节制动产生的机械应力缺失是造成软骨修复障碍的重要因素之一[5]。虽然在临床常规治疗上，早期制动对创伤骨折及运动性肌肉损伤患者急性期有应激保护的作用,可以减轻组织炎症反应。但同时软骨细胞中的压力感受器控制着软骨细胞功能的调节,参与细胞外基质稳态的维持，长期的应力缺失会破坏这种稳态,导致细胞生物活性和基质生成减少,软骨胶原网破坏,促进破骨细胞形成，造成关节骨质以及软骨细胞退行性变[6]。而关节退行性变也会根据制动方法的不同而产生差异，目前运用较多的关节制动方法有石膏固定法、新型外固定支具(聚丙烯板材制作)、Ilizarov外固定器等。

1.1.1石膏固定法 最经典的关节制动就是Videmen造模法，通过传统管型石膏固定兔膝的伸直位，但是存在支具脱落、动物关节磨损等很多缺陷[7]。摆雪等[8]用石膏固定兔的膝关节屈曲位后，在石膏外层以铁丝固定，成功取得骨性关节炎动物模型。该方法虽然经济实惠，但未能有效防止支具被动物啃咬而导致的脱落，且外层铁丝的固定容易造成石膏内部不平整，增加石膏与关节面的摩擦，促进关节炎症反应，影响实验结果。吴清洪等[9]采用内层应用厚棉垫铺垫，外层铺普通石膏后，最外层铺设高分子聚乙烯材料的方法建立骨性关节炎动物模型，避免了因关节与石膏磨损产生炎性细胞对实验结果的影响，成功预防了动物本能对支具啃咬导致石膏啃脱而影响实验结果，值得借鉴。

1.1.2新型外固定支具 在新型外固定支局实验中，张劲等[10]尝试用绝缘塑料胶带缠绕兔的踝关节后，再用聚丙烯材料制成的新型外固定支具前后固定兔膝大腿于伸直位，6周后取活组织病理检查，观察到KOA表现，证实建模成功。相比常规石膏固定法，此法有效规避了传统死板的石膏固定造成的兔下肢肿胀、固定部位毛皮脱落以及爪部局部充血红肿发炎等并发症，而且新型支具尝试性借助绝缘塑料胶带的黏附性使其固定于动物毛皮，支具固定的位置距关节也保持一指距离，便于安装、拆卸的同时，其舒适松软的环境也不会机械性地压迫兔膝关节，对兔的肛门造成应力摩擦的减小也减少了肛门溃烂的发生，改善了实验动物的生活质量，提高存活率，值得借鉴。

1.1.3Ilizarov外固定器 Ilizarov技术，即在细钢针穿骨后造成的张力下固定关节的环形固定器，最早由俄罗斯外科医师Ilizarov于20世纪60年代提出[11]。Ilizarov技术中涉及的绝大部分操作是微创操作，切口小，其细针的插入降低对骨周围组织，如软组织、骨膜、骨髓等组织的侵袭，有效规避了关节周围组织炎症对KOA动物模型的影响[12]。其细针牵张后的关节腔既能保持较强的稳固性，又能满足骨生长所需的微动。Dehghan等[13]将Ilizarov固定环固定于猪膝关节上、下5 cm处，固定环间隙略小于正常生理值，以保持关节面负重。在固定环分别钻入2根1.5 mm克氏针，固定环之间用延长棒固定，将每个平面的克氏针针尖角度控制在10°～20°，8周后取活组织病理检查，可见膝关节软骨退化等骨性关节炎典型表现。

1.2关节撞击法 许多实验专家提出，虽然机械制动法、手术造成关节失稳等方法均能造成骨性关节炎，但是与临床上创伤引起的关节退行性变的机制并不太相符。Redler等[14]设计了关节撞击软骨模型，他们应用垂直撞击架，垂直撞击兔的股骨内侧髁，撞击时间>12周，造成股骨关节不同程度损伤，病理切片发现软骨损伤机制与临床软骨退行性变病理损伤机制类似。Mrosek等[15]用“落塔”微重力装置对12支发育正常的实验犬的髌骨关节进行撞击，24周后对撞击区进行活组织取样检查，结果表明有明显软骨基质退行性变，呈早期骨性关节炎表现。

1.3关节腔内药物注射

1.3.1木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶本质是一种蛋白水解酶，其对关节基质的蛋白多糖有分解作用，并能消耗软骨细胞膜上有丝分裂抑制因子，加快关节基质退行性变[16]。ükür等[17]将4%木瓜蛋白酶注入小鼠关节腔内，4周后对实验组进行关节软骨组织学检查，结果显示木瓜蛋白酶作用关节表面呈不规则化、纤维化，关节软骨减少，出现早期KOA表现。汪宗保等[18]将混有木瓜蛋白酶的L-半胱氨酸注入大鼠关节腔内，并通过新型环境扫描电镜发现大鼠关节出现早期骨性关节炎表现，该研究还发现，运用新型环境扫描电镜可早期发现骨性关节炎变化，有助于KOA的早期研究。

1.3.2碘乙酸钠 碘乙酸钠又称碘醋酸钠，是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抑制剂，能引起软骨基质的退行性变、软骨细胞的降解和丢失、滑膜炎性改变等，其引起的关节病变与人类骨关节炎性变病理机制相似[19]。张文强等[20]在大鼠膝关节炎的建模中，将0.1 mL 4%碘乙酸钠溶液50 μL注入大鼠膝关节腔，8周后处死大鼠，将膝关节软骨组织活检，发现大鼠Makin评分为(5.09±1.354)分，证实骨性关节炎造模成功。许世兵等[21]将碘乙酸盐注入大鼠关节腔内，2周后通过组织病理检查发现股骨下端胫骨平台不整，关节软骨缺失，软骨细胞丢失，股骨和胫骨端骨质疏松，骨小梁面积显著减少，证实成功建立大鼠KOA模型。

1.3.3瘦素 由肥胖基因编码的瘦素实质上是一种由脂肪细胞分泌的多肽类激素，早期研究认为瘦素是脂肪细胞分泌的一种小分子激素,在中枢水平有着饱感因子的作用，主要调节食物摄入的增减，促进体内能量的消耗[22]。研究发现,瘦素在机体内可发挥多种生理作用,并与OA病情有关[23]。在炎症反应中，瘦素能够活化单核/巨噬细胞，增加炎性因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6分泌，并促进T细胞向Th1细胞转化，表达γ干扰素、白细胞介素2[24]。Hick等[25]将瘦素注入SD小鼠关节两周后，取出关节软骨活检，证实关节炎小鼠局部注射瘦素后，不仅能够诱导骨性关节炎提前发作，还能加重关节炎症。

1.4外科手术介入

1.4.1破坏关节稳定性 关节稳定性是指人体关节在静止或运动中维持正常位置的能力，膝关节是人体最复杂的关节，关节囊薄而松弛，稳定性主要靠髌韧带、交叉韧带、双侧副韧带、斜韧带以及双侧半月板维持，生理结构任何一环节的损伤都会影响膝关节稳定性，所以在动物建模中，可通过破坏关节的稳定性诱导关节腔内受力失衡，增加关节面的摩擦，加快实验动物骨性关节炎发展的进程。

1.4.1.1Hulth法 Hulth法是骨性关节炎动物建模的经典方法之一[26]，研究人员将一侧膝关节前、后十字交叉韧带及同侧副韧带离断，并破坏部分内侧半月板，使得关节失稳，关节面之间的摩擦增大，半月板结构的失衡也使得关节腔内缓冲作用减小易导致KOA。肖春苟等[27]切断内侧副韧带，去除内侧半月板，术后1周便强迫运动，4周后取活组织病理检查，发现关节面粗糙，关节软骨退化，可见明显骨性增生，成功建立兔KOA模型。Zhou等[26]在利用Hulth法后，取活组织苏木精-伊红染色后可见软骨变薄，表面不光滑，软骨细胞排列紊乱，出现多个空隙，软骨表面退行性变，符合膝关节炎性变表现。

1.4.1.2交叉韧带离断术 交叉韧带是防止胫骨移位、维持膝关节稳定性的重要结构之一，与膝关节屈曲伸直位、肌肉收缩状态、负重或非负重区都有关系。交叉韧带离断术可分为单纯前十字交叉韧带离断术和单纯后十字交叉韧带离断术[28]。单纯前十字交叉韧带离断术可以改变关节前向稳定，增大关节间活动度，增加骨摩擦，加快关节退行性变进程。Elmorsy等[29]对兔行单纯前十字交叉韧带离断术术后，并将健侧肢体固定于腹部，增加实验侧肢体负重，术后3 d强制运动，4周后出现关节积液，病理检查发现滑膜增生，证实兔膝关节退行性变。单纯后十字交叉韧带离断术改变了膝关节后向稳定性，对关节的作用机制同单纯前十字交叉韧带离断术。陈刚等[30]对兔行单纯后十字交叉韧带离断术后，术后3个月可见活组织病理检查见软骨不平整，软骨细胞损伤，证实关节退行性变。

1.4.1.3单纯半月板切除术 膝关节半月板有增加胫骨髁凹陷及衬垫股骨内外髁的作用，以增加关节的稳定性，缓冲关节腔震荡，半月板的缺失可增加关节间的磨损，加快关节软骨退行性变。刘俊才等[31]通过关节镜切除小型猪双膝外侧半月板，术后12周即可观察到关节出现局限性关节表面纤维化，股骨髁间隙出现骨质增生，组织学结果显示，软骨细胞数量和蛋白多糖数量减少，软骨细胞成簇排列，KOA形成。Steinbrück等[32]采用切除单侧大鼠内侧半月板的方法，并将健侧肢体固定于腹部，增加实验侧负重，术后4、6、10周大体观察和术肢标准病理改变均符合典型KOA特征。

1.4.2关节划痕法 通过关节划痕可造成关节软骨缺损，在关节自我修复的过程中，可观察KOA的发展过程及修复进程，建立早期模型。但此种方法容易并发滑膜炎症，会影响对关节软骨炎症的发生、修复的观察。Vos等[33]在犬的膝关节股骨髁负重区造成划痕，同时避免损伤软骨周围软组织，10周后观察发现软骨损伤，软骨细胞聚集，软骨中金属蛋白酶缺失，关节内胶原损害，蛋白多糖改变符合KOA表现。Marijnissen等[34]表示，该方法与单纯前十字交叉韧带离断术所得出的动物模型表现相似，但是关节软骨对关节划痕法的敏感性远低于单纯前十字交叉韧带离断术，有利于建立骨关节炎早期表现。李钊等[35]用小针刀在兔子股骨髁软骨面上进行刻痕，由于采用闭合刻痕法，切口较小，术后第2天开始强制运动，5周后取出造模侧关节软骨，有典型的骨关节病理改变。

1.4.3破坏关节血液循环 膝关节血液循环障碍可诱发关节周围软骨缺血性损伤，是临床上常见的导致KOA的原因之一。Cheng等[36]对兔子行手术分离并结扎单侧股静脉，造成股骨干骺端及髓内血液供应阻断，股骨内高压，术后2 d强迫运动，10周后发现软骨表面粗糙，表层出现裂隙，软骨细胞退变，呈巢状增生，表明早期内获得动物骨性关节炎模型。戴七一等[37]采用手术切断兔单侧臀下静脉、股静脉、大隐静脉的方式，造成股骨内高压，8周后及获得兔KOA模型。

1.4.4卵巢切除术 研究发现，切除SD雌性大鼠行卵巢后，成骨细胞及破骨细胞活性升高，但其中，成骨细胞升高只是短暂性的，而破骨细胞则呈持续性升高，持续的时间甚至可以达到术后数周，导致SD大鼠体内破骨细胞在很长时间内保持一个相对较高的水平，破骨细胞活性高于成骨细胞，致使骨吸收增多，导致SD大鼠骨质疏松，诱发骨性关节炎[38]。Kim等[39]将鼠卵巢切除后，发现代表骨吸收的Ⅰ型胶原C端肽及代表软骨变化的Ⅱ型胶原C端肽明显升高，且随着时间的推移，两者激素的水平与关节退行性变呈相关性，4周后可见大鼠股骨表面呈淡黄色，粗糙不平，胶原纤维变性，失去弹性，关节边缘有骨质增生。王文胜等[40]采用大鼠卵巢切除联合上下台跑步的方法建立动物KOA模型，对SD大鼠行卵巢切除术后2 d开始强制上下坡跑步运动，4周后即可观察到大鼠膝关节退行性变。

2 自发型动物模型

除人类以外，许多动物也会自发形成骨性关节炎，且形成机制与人类相似。与诱发型动物模型相比，自发型动物模型在自然条件下形成，未经人为干预，干扰因素少，因此实验操作更为简便，动物管理相对容易，避免了操作误差，取得的KOA模型更接近临床病理表现[41]。目前，自发性动物模型在许多动物实验建模中普及，常用的动物有Hartly豚鼠、C57黑鼠等。Hartly豚鼠软骨降解主要在负重区，与人类骨关节炎发生进程相似，Scott等[42]研究12个月龄雄性Hartly豚鼠膝关节，发现普遍关节软骨不平整，软骨细胞减少，胶原排列紊乱，糖胺聚糖异常分布，可做KOA模型。Pang等[43]在对C57黑鼠的自然饲养过程中，同样发现10月龄的C57黑鼠可以天然自发形成骨性关节炎。自然条件形成的骨性关节炎动物模型形成过程缓慢，标本制作的时间长，所需费用高，这也成为制约自发型动物模型发展的瓶颈。

3 转基因动物模型

据统计，人类38%～65%的KOA发病患者有一定的遗传背景[44]。而随着基因工程基准基因技术的发展，现代科学可以人为制造动物骨性关节炎遗传基因，其遗传机制甚至与人类相似。小鼠因其重复性好，样本易于获得且造模周期短，常被作为KOA基因型动物模型，目前多个小鼠标记基因已用于骨关节炎的基因转染、基因敲除。丁道芳等[45]就成功激活调控软骨细胞凋亡的相关基因，促使软骨细胞过度凋零，以此模仿长时间劳损造成的骨关节炎病理过程。于斐等[46]尝试敲除15月龄小鼠沉默信息调节因子1,并向腹腔注射Tamoxifen，导致胶原本能合成正常的胶原纤维，致使小鼠出现KOA表现。转基因动物模型可减少手术、关节腔注射及关节制动等造成的操作误差，在研究骨关节炎的起始机制、关节软骨生化的改变等方面有明显的优势，很好地排除了感染、创伤对骨关节炎动物模型软骨、滑膜的影响，同时也减轻了建模过程中给动物带来的痛苦。

4 展 望

KOA病因复杂，与多种因素有关。在研究过程中，不同的动物物种表现的病理发展过程不尽相同，各种模型都有其优缺点。在选择动物模型时，应全面考虑其生活习性、关节特征、关节力学特征。一个理想的KOA动物模型可以帮助进一步了解KOA病因病理，寻找更有效的治疗方式，建立统一、客观的疗效评估。然而到目前为止，还并未建成一个理想的骨性关节炎动物模型。相信随着KOA建模方法的不断完善，在预防、治疗KOA方面会取得突破性进展。