Tim-3介导肿瘤免疫逃逸和免疫治疗的研究进展

李 霞, 陈治中, 何松哲, 李 政

(1.桂林医学院附属医院检验科，广西 桂林 541001； 2.广西中医药大学瑞康临床医学院，南宁 530011；3.广西壮族自治区人民医院检验科，南宁 530021)

免疫治疗是当前肿瘤免疫学的研究热点，可通过识别和抑制肿瘤提高机体免疫功能，但免疫抑制状态的存在成为免疫治疗的最大障碍，因此探究免疫抑制的形成机制及其有效逆转模式是当前肿瘤防治有待解决的关键问题[1]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim)-3在免疫细胞和肿瘤微环境中高表达，不仅调控机体的免疫功能，还参与肿瘤的免疫逃逸和侵袭转移，与肿瘤临床分期和治疗转归密切相关，调控Tim-3相应信号通路的生物学特征有助于激活T细胞的功能和活性，抑制肿瘤生长[2-3]。现就Tim-3及其配体的分子特征和功能以及Tim-3介导肿瘤免疫逃逸和免疫治疗的研究进展予以综述，以期为肿瘤免疫靶向治疗提供依据和新的思路。

1 Tim-3的分子特征及其表达

Tim-3属于Tim家族中具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白，于2002年首先在活化的辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)1中发现，被认为是Th1细胞特定表达的一类抑制性分子[4]。随后有研究发现，Th1细胞、Th17细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞上均可检测到Tim-3表达，甚至自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)、树突状细胞(dendritic cells，DCs)、肥大细胞以及肿瘤相关巨噬细胞等表面也存在Tim-3的表达，表明Tim-3不仅参与机体适应性免疫反应的调控，还参与机体天然免疫反应的调控[5]。进一步研究发现，Tim-3在多种实体肿瘤细胞表面也有表达[2-5]。Tim-3还可以可溶性方式分泌到细胞外，但其在细胞外的生物学功能尚不确定[6]。

人体内Tim-3分子是由301个氨基酸构成的跨膜糖蛋白，其结构包括免疫球蛋白域、细胞外的糖基黏蛋白、跨膜区和细胞内的C短尾部(由酪氨酸组成保守信号基序)[2-3]。Tim-3通过细胞外免疫球蛋白域与其配体相互作用，免疫球蛋白域在二硫键作用下，由6个半胱氨酸残基构成一个与配体结合的“口袋”样结构，该结构是Tim家族的特征性识别结构[7-8]。Tim-3通过与其配体相互作用诱发一系列信号传递，并与T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号链相互作用，从而抑制免疫细胞功能，诱导T细胞、NK细胞等免疫活性细胞的凋亡，参与肿瘤免疫抑制、自身免疫性反应、变态反应、移植排斥反应等多种免疫性疾病的发生发展[9]。

2 Tim-3配体及其相互作用

Tim-3配体通过与Tim-3免疫球蛋白域的相互作用发挥生物学活性功能。Tim-3配体主要有3种，其中研究最早、最主要的Tim-3配体是半乳凝素-9(galectin 9，Gal-9)，之后发现有高迁移率组蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)和癌胚抗原细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule-1，Ceacam-1)[3,10]。Tim-3在外周血和肿瘤微环境中呈高表达，通过与配体相互作用转导抑制性信号来调控免疫功能[11]。然而，Tim-3传导共刺激信号和发挥免疫抑制作用是否必须依赖与配体的交联、Tim-3与各配体结合是否具有协同效应和交叉对话等还需要大量试验研究的阐明。

2.1Gal-9 Gal-9是首个被识别的Tim-3天然配体，属于S型凝集素，由两个糖基识别结构域通过一条肽链相连而成，是一种广泛性表达的可溶性分子，可以不同程度在肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、抗原呈递细胞、调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、内皮细胞中表达[12]。糖基化的Tim-3的免疫球蛋白域可与Gal-9相互作用，引起Tim-3胞内段结合的HLA-B关联转录因子3(HLA-B associated transcript 3,BAT3)发生解离，刺激钙离子进入活化的T细胞内，通过诱导T细胞凋亡抑制T细胞介导的免疫反应[13-14]。在小鼠模型中发现，Tim-3和Gal-9表达下降与促炎细胞因子[肿瘤坏死因子-α和白细胞介素(interleukin，IL)-1β]增加以及抗炎细胞因子(转化生长因子-β和IL-10)下降相关；同时还发现，巨噬细胞向M1型极化增加，而用Gal-9进行重组处理后则出现相反现象，由此推测，Tim-3/Gal-9信号通路可通过调控细胞因子分泌和巨噬细胞极化参与肿瘤的生长和侵袭转移[15]。但其因果关系仍需通过分别阻断肿瘤模型的Gal-9和Tim-3并检测阻断前后各种细胞因子的变化水平及其与M1极化的关系来阐明。

2.2HMGB1 HMGB1是定位于细胞核内的非组蛋白成分，其对肿瘤、感染等损伤性刺激异常敏感，可由活化的DCs释放，介导肿瘤细胞和感染细胞等释放的进入细胞核囊泡的核酸内吞，可清除免疫原性物质，在抗肿瘤和抗感染免疫中起桥梁作用[16]。与正常组织DCs相比，肿瘤微环境中浸润的DCs可高表达Tim-3，且Tim-3与肿瘤细胞释放的核酸性抗原竞争性结合HMGB1的同一结构域，可阻断核酸与HMGB1复合物的形成，抑制HMGB1介导的核酸进入核内囊泡的固有免疫信号转导[17]。因此，可将阻断Tim-3/HMGB1信号通路(即解除肿瘤微环境中DCs对肿瘤释放核酸所激发免疫反应的抑制作用)作为开发预防肿瘤DNA疫苗和肿瘤化疗的理论依据。一项对白血病的研究发现，Tim-3/HMGB1通路可通过影响肿瘤坏死因子-α和IL-1β的分泌促进急性髓系白血病细胞的免疫逃逸[18]。

2.3Ceacam-1 Ceacam-1广泛分布于免疫细胞、上皮细胞和肿瘤细胞上，可以跨膜形式存在于细胞上，也可以分泌形式存在于体液中，通过细胞间黏附作用转导信号，参与细胞增殖、分化、凋亡，并可参与管腔结构形成以及调节免疫反应[2-3]。Ceacam-1可以与糖基化Tim-3免疫球蛋白域的FG-CC环结合，以传递免疫抑制信号和诱导免疫耐受[2-3]。Tim-3/Ceacam-1的相互作用可产生与Tim-3/Gal-9通路类似的效应，也可引起Tim-3胞内段结合的BAT3发生解离，刺激钙离子进入活化的T细胞内而诱发凋亡[13]，可见，Tim-3/Ceacam-1和Tim-3/Gal-9信号通路可能存在协同效应。Tim-3上HMGB1结合域与Ceacam-1结合域的结构存在重叠，Tim-3配体结构域“FG-CC环”中的Q62 (人类是E62)是Tim-3与HMGB1和Ceacam-1相互作用的必需氨基酸残基[13,19]。目前，Tim-3与配体HMGB1和Ceacam-1之间是否存在竞争性结合及交叉对话尚不清楚，表明HMGB1和Ceacam1介导的Tim-3信号通路的细胞类型特异性尚有待进一步研究的确认。对结肠癌、非小细胞肺癌等实体肿瘤研究证实，Ceacam-1和Tim-3单克隆抗体联合阻滞可有效增强抗肿瘤免疫应答[19-20]。

3 Tim-3与免疫细胞介导的肿瘤免疫耐受

Tim-3与其配体相互作用后可传递抑制信号，发挥抑制免疫细胞功能、减少促炎细胞因子产生、抑制免疫细胞增殖的作用，然而通过Tim-3单克隆抗体尤其是联合使用程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death-1，PD-1)单克隆抗体阻断其相互作用可增加细胞因子产生、促进细胞增殖、抑制肿瘤生长[13,21]。但对感染结核小鼠模型的研究发现，Tim-3可传递相反信号而促进巨噬细胞的抗感染免疫，并在Gal-9阴性巨噬细胞上丧失此功能[22]。目前，Tim-3免疫抑制作用的机制尚不明确。现对T细胞、NK细胞、TAMs及髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)与Tim-3的可能肿瘤免疫耐受和逃逸机制予以阐述。

3.1Tim-3与T细胞 T细胞可在局部微环境和体液因子等的调控下分化为成熟免疫细胞和效应细胞，调控机体的体液免疫和细胞免疫[23]。Tim-3信号通路及其与TCR信号的耦合机制对T细胞功能的影响还有待探索，尚无统一定论。动物实验研究认为，Tim-3与Gal-9等配体结合可使结合在Tim-3细胞尾部的BAT3解离，TCR信号和CD28共刺激信号可激活非受体酪氨酸激酶Src家族成员Lck和Fyn信号分子，促进Tim-3胞内保守络氨酸残基(鼠类Y256和Y263位点，人类Y265和Y272位点)的磷酸化，进而招募P85接头蛋白来促进磷脂酰肌醇-3-激酶的活化，从而促进Tim-3+T淋巴细胞的增殖和活化[2-3,24]。对Jurkat细胞的研究发现，Tim-3+Jurkat细胞与Gal-9相互作用可抑制TCR信号介导的活化T细胞核因子和核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的活化，进而抑制T细胞的活性[2-3]。将经CD3/CD28激活的人外周血单个核细胞与脂肪干细胞共同培养发现，CD4+T细胞和CD8+T细胞的PD-1和Tim-3表达增加，NF-κB磷酸化水平、细胞增殖能力、γ干扰素的产生均降低，细胞凋亡增加；而经抗程序性细胞死亡配体-1和Gal-9单克隆抗体阻断后，CD4+T细胞和CD8+T细胞的NF-κB磷酸化、细胞增殖能力、γ干扰素产生均恢复，且细胞凋亡降低，证实Tim-3/Gal-9可通过调控NF-κB的活化来调控T细胞的功能和活性[25]，但该实验并未研究分别阻断PD-L1/Gal-9/NF-κB、Tim-3/Gal-9/NF-κB以及TCR信号通路对细胞凋亡的影响。

Tim-3相关信号通路对免疫细胞的调节可能受到免疫细胞种类及其活化状态的影响。肺细胞癌患者T细胞高表达Tim-3与T细胞耗竭有关，抗体阻断Tim-3/Gal-9信号通路后可逆转T细胞耗竭状态[5,26]。与单独应用Tim-3或PD-1单克隆抗体相比，Tim-3与PD-1单克隆抗体联合应用的抗肿瘤作用以及对T细胞功能恢复的作用明显增强，可能与肿瘤浸润性淋巴细胞共表达PD-1、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、Tim-3等抑制分子，且其联合阻断可有效恢复机体的抗肿瘤免疫功能有关[21,27]。

3.2Tim-3与NK细胞 肿瘤患者外周血和肿瘤微环境浸润的NK细胞高表达Tim-3，几乎所有的成熟CD56dimCD16+NK细胞均表达Tim-3，细胞因子IL-12、IL-15和(或)IL-18可诱导未成熟的CD56brightCD16-NK表达Tim-3，在肿瘤浸润淋巴细胞中，NK细胞表达Tim-3的比例最高，故认为Tim-3是NK细胞成熟和活化的标识[2]。NK细胞中的Tim-3与Gal-9结合后，胞内酪氨酸残基尾部发生磷酸化，BAT3发生解离，可招募Src激酶成员Fyn到胞内同一结合位点，从而抑制Fyn信号对细胞增殖和活化的刺激，导致NK细胞耗竭[27]。但目前Tim-3对NK细胞功能的调节作用仍存在争议。阻断感染乙型肝炎病毒等慢性感染者的Tim-3，NK细胞毒性和γ干扰素的分泌能力增强[28]。Tim-3在黑色素瘤患者NK细胞中的表达也增加，但采用单克隆抗体阻断Tim-3后，NK细胞呈耗竭状态，且分泌γ干扰素的能力降低[29]。因此，NK细胞上Tim-3的功能尚有待进一步研究。

3.3Tim-3与TAMs 肿瘤微环境中可见大量的Tim-3+TAMs浸润，TAMs的浸润程度、极化状态以及Tim-3的表达量均与肿瘤的发生和侵袭转移相关[30-31]。TAMs衍生的IL-6可活化JAK激酶2/信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3信号，活化的STAT3转录抑制肿瘤抑制因子miR-506-3p(调控FoxQ1的关键微RNA)，导致FoxQ1表达增加，进而促进募集巨噬细胞的趋化因子(如CC趋化因子配体2)增加，使更多TAMs聚集在肿瘤微环境中，促进肿瘤的侵袭和转移，通过阻断CC趋化因子配体2或IL-6可破坏以上恶性循环，减少巨噬细胞聚集[32]。可见，肿瘤微环境中巨噬细胞和肿瘤细胞的STAT3/miR-506-3p/FoxQ1/CC趋化因子配体2信号轴有望成为肿瘤治疗及其免疫调控的关键靶标。

3.4Tim-3与MDSCs 在肿瘤微环境中，MDSCs产生的精氨酸酶1、一氧化氮合酶和活性氧类等有显著的免疫抑制作用，并与肿瘤发展和患者预后密切相关[33]。对胃癌患者的研究证实，MDSCs上Tim-3的表达水平与肿瘤转移及其临床分期相关[34]。T细胞上Tim-3基因受CD2启动子的驱动而呈过表达，可进一步诱导粒细胞样MDSCs的产生，并参与肿瘤预后和转归[35]。对白血病的研究发现，T细胞表达的Tim-3可诱导MDSCs扩增，促进MDSCs分化为TAMs，而TAMs可通过细胞外基质重构、血管生成和淋巴管生成来促进肿瘤干细胞的增殖和存活。可见，在肿瘤微环境中，Tim-3可通过与TAMs和MDSCs协同作用介导肿瘤的免疫逃逸[36]。

4 Tim-3介导肿瘤免疫治疗及其机制

免疫检查点分子(如PD-1、CTLA-4和Tim-3)在肿瘤患者外周血单个核细胞以及肿瘤微环境肿瘤浸润性淋巴细胞中的表达增多，其与相应配体结合后，通过Fyn/p85/磷脂酰肌醇-3-激酶等信号通路抑制免疫细胞功能，促进肿瘤的生长和侵袭转移，应用单克隆抗体阻断免疫检查点分子与其配体相应信号通路后，可逆转免疫细胞的耗竭，抑制肿瘤发展，为肿瘤治疗中检查点的阻断提供依据[2-3,13,37-38]。

2011年，Ipilimumab作为抗CTLA-4免疫治疗药物被批准用于转移性黑色素瘤的治疗，但其治疗有效率较低[2-3]。随后，美国食品药品管理局批准抗PD-1药物Pembrolizumab用于黑色素瘤和头颈鳞状细胞癌的治疗。Nivolumab是美国食品药品管理局批准的第二种抗PD-1单克隆抗体，其对多种恶性肿瘤(非小细胞肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌等)均具有治疗作用，可使部分患者的肿瘤细胞呈迅速持久地消退。研究表明，Nivolumab和Ipilimumab联合使用可显著提高对恶性肿瘤的治疗效果，与单独使用Ipilimumab或Nivolumab相比，可显著延长患者生存时间[13]。但需要重视因免疫治疗导致的细胞毒性反应等不良反应，且抗PD-1和抗CTLA-4联合治疗仅对约50%的黑色素瘤患者有显著疗效，有些肿瘤患者对以上两个检查点阻断治疗均无反应[2-3]。

鉴于Tim-3在免疫细胞上的选择性表达及其结构的独特性，可以通过靶向治疗提高其治疗精确性并降低其非特异性细胞毒性反应。此外，Tim-3下游信号通路的抑制机制较明确，与CTLA-4和PD-1下游信号通路存在较大差异[2-3,32]。由此可见，Tim-3独特的表达及其细胞内信号通路对靶向Tim-3的肿瘤免疫治疗具有很大的应用潜力。

5 展 望

目前，基于免疫检查点分子和肿瘤免疫的研究已经得到了大量的信息和数据，且正在进行肿瘤免疫治疗方案的合理组合和尝试，并取得了一定成果。在肿瘤免疫中，一些新型免疫抑制性共刺激分子(如淋巴细胞活化基因3、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白、B和T淋巴细胞弱化因子等)的作用及机制尚不明确，其与Tim-3等分子的关系还需要进一步阐明[38]。此外，Tim-3及其配体信号通路结构和功能以及与淋巴细胞活化信号通路的交叉对话等问题尚未完全阐明，且尚缺乏联合应用细胞因子等生物学活性因子治疗方案的相关动物实验和临床试验研究，阻断抗Tim-3单克隆抗体的结局亦存在不确定性，因此，还需要大量的实验研究以优化相关肿瘤免疫治疗。