p38 MAPK信号通路与糖皮质激素抵抗型哮喘的关系

穆凯代斯·赛迪，杨晓红

(1.新疆医科大学,乌鲁木齐 830011； 2.新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学科，乌鲁木齐 830001)

支气管哮喘(哮喘)是一种嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等细胞以及细胞组分共同参与，以可逆性气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病，影响着不同国家中1%～18%人口的健康[1]。糖皮质激素(glucocorticoids，GC)是目前国际上公认的治疗哮喘最主要的药物，已被临床普遍应用。从哮喘患者目前的治疗状况来看，临床上有些哮喘患者对治疗药物的敏感性有所下降，有些患者即便长期规律使用激素并且接受规范治疗，疗效仍然欠佳[2]，有些患者甚至对激素药物抵抗。1968年，Schwartz等[3]第一次提出激素抵抗型哮喘(steroid-resistant asthma,SRA)的概念，1981年，Carmichael等[4]根据GC受体治疗后第1秒用力呼气容积的改善率将哮喘分为SRA和激素敏感型哮喘(steroid-sensitive asthma,SSA)。临床上一般将这类在呼吸科医师指导下和保障依从性并且用药规范的前提下对激素治疗不敏感，口服泼尼松龙(剂量≥40 mg/d)治疗1～2周后，第1秒用力呼气容积改善不超过15%的哮喘称之为SRA。这类患者疗效欠佳，疾病进展速度快，病情严重。抵抗的发生机制尚不完全清楚，国内外研究发现，p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)亚型在SRA的发病过程中起重要作用，p38 MAPK亚型的抑制剂能逆转SRA患者对激素的敏感性[5]，现对p38 MAPK信号通路及其与SRA患者关系的国内外研究进行综述。

1 MAPK及p38 MAPK信号转导途径及其作用

细胞对细胞外刺激的反应是由许多细胞内激酶和磷酸酶介导的。MAPK是各种细胞外刺激的焦点，被不同的细胞外刺激，如细胞因子、激素、细胞应激等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK是将信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，一般将MAPK分为3个亚型：细胞外调节蛋白激酶、p38、c-Jun氨基端激酶。MAPK的组成是一种保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶、MAPK[6-10]，这3种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、应激和炎症反应等重要的细胞生理和病理过程。

p38由4种亚型(p38α、p38β、p38γ和p38δ)组成，它们通过上游激酶的磷酸化底物调节细胞活性。p38组激酶被双激酶激活，即为MAPK激酶，并且磷酸化其下游底物的特定丝氨酸和苏氨酸。p38通路被促炎因子、细菌病原体及其代谢产物磷酸化激活，激活后的p38 MAPK由胞质进入细胞核内，活化转录因子，调节特定的基因表达参与应激条件下细胞的免疫炎症反应及细胞生长、细胞分化、细胞周期和细胞死亡过程[11-14]。p38在炎症中通过以下方面起着重要作用：①产生促炎细胞因子，如白细胞介素(interleukin,IL)1b、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6[4]；②诱导环加氧酶2等酶[15]，控制病理状态下的结缔组织重塑；③调节氧化作用的细胞内酶(如一氧化氮合酶)[16]的表达；④诱导黏附蛋白(如血管细胞黏附分子1)和许多其他炎症相关分子[17]。

2 GC的作用

GC是哮喘等几种疾病的有效抗炎药,能有效控制大多数患者的哮喘，但仍有少数患者对其反应性较差，需要吸入或口服高剂量的GC，其中一小部分患者表现出对GC完全抵抗。GC可以抑制其他转录因子，如激活蛋白1和核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)，通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用激活NF-κB等的靶基因，这种作用被称为转录抑制。此外，GC还可以在抑制促炎激酶级联系统的作用中发挥作用。

2.1激活抗炎基因表达GC GC通过与细胞质GC受体结合起作用，两者结合后转运至细胞核。在细胞核内，GC受体作为二聚体与类固醇敏感基因的启动子区域内DNA上特定的GC反应元件结合，并且直接或间接与共激活因子分子(如环腺苷酸效应元件结合蛋白)结合[14,18]，p300/环腺苷酸效应元件结合蛋白活化因子或类固醇受体辅激活因子2具有内在的组蛋白乙酰转移酶活性，导致组蛋白H4上的赖氨酸乙酰化，导致编码抗炎蛋白的基因活化，如分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、促分裂原活化的蛋白激酶磷酸酶1(mitogen activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)、NF-κB抑制剂。这些基因编码细胞因子、趋化因子、炎症酶和受体中的黏附分子，通过与转录共激活因子相互作用以与GC受体介导的基因转录相似的方式被激活。活化的GC受体与共抑制因子分子相互作用，以减弱NF-κB相关的共激活因子活性，进一步通过激活的GC受体将组蛋白去乙酰化酶2特异性募集到激活的基因复合物中，从而减少组蛋白乙酰化，有效抑制细胞核内炎症基因的激活[14]。

2.2抑制Th2细胞 GC治疗哮喘等过敏性疾病的另外一个重要作用是通过抑制Th2细胞和Th2细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5和IL-13)实现的。该过程由转录因子GATA3介导，p38 MAPK磷酸化后，输入蛋白α将GATA3从细胞质转移至细胞核[19]。因GC受体与输入蛋白α竞争核输入，并且诱导MKP-1逆转p38 MAPK对GATA3的磷酸化，GC有效抑制了GATA3核转位。

3 SRA与p38 MAPK的关系

3.1p38 MAPK参与发生激素抵抗的环节 激素抵抗是包括哮喘在内的很多慢性炎症性疾病共同存在的问题。相比SSA，SRA患者的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中p38活化选择性增加，p38 MAPK过度活化已被认为是SRA的一种机制。

3.1.1SRA与促炎因子 p38 MAPK被细菌病原体及其代谢产物等磷酸化激活，在疾病严重的情况下，大量产生促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和自由基，从而使MAPK大量活化，导致GC作用减弱。Bhavsar等[20]用脂多糖刺激不同严重程度哮喘患者的肺泡巨噬细胞，并得出结论：类固醇反应性与p38 MAPK活化程度相关，哮喘的临床严重程度与哮喘患者气道中磷酸化p38的表达之间存在关联。p38 MAPK可以调节许多促炎细胞因子的产生，例如IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、TNF-α。另外一些研究在SRA患者的支气管肺泡灌洗液中检测到与经典巨噬细胞活化相关的多种炎症基因的表达，且IL-2、IL-4、IL-8和TNF-α水平升高[21-22]。有研究通过将PBMC与IL-2/IL-4一起孵育，在体外诱导GC受体亲和力降低。细胞与IL-2和IL-4的联合处理导致促炎细胞因子的表达增加和抗炎细胞因子IL-10等的表达降低。在用IL-2和IL-4预处理的PBMC中，GC调节IL-10的产生和抑制脂多糖刺激的促炎细胞因子释放的能力降低[23]。这表明有利于促炎状态的细胞因子产生的平衡可能影响哮喘严重程度。这种作用的分子基础可能是IL-2/IL-4可通过细胞核内的p38 MAPK使丝氨酸残基(可能是丝氨酸226)磷酸化改变GC受体的功能和活性。这些细胞因子体外组合不仅可降低单核细胞核内的GC受体核转位和结合能力，还可以通过p38磷酸化转录因子GATA3，从而促进Th2的激活并且降低对GC敏感性[24]。

3.1.2SRA与基因 Vingerhoeds等[25]对大约30例患有皮质醇耐药的患者和无症状家庭成员中8例患者进行分子基础鉴定，发现其中7例患者GC受体基因激素结合域的突变是控制皮质醇抗性临床症状的原因、1例患者显示DNA结合结构域的突变。SRA患者存在家族聚集现象，提出了该病具有基因遗传性。Hakonarson等[23]分别从SRA和SSA患者外周血细胞里鉴别出L78440等多个基因。在后期研究中发现家族性SRA患者的外周血细胞中GC受体突变引起GC受体功能异常,但在非家族性的SRA中没有发现GC受体突变。然而Matthews等[24]发现SRA患者的GC受体3.2结合和转移位点缺失，导致IL-2和IL-4的表达显著增高，IL-2和IL-4通过p38 MAPK通路使GC受体磷酸化，从而降低GC受体的核转移和与DNA结合的能力以及GC的抗炎作用，引起对GC治疗的不敏感。

3.1.3SRA与MKP-1 MKP-1是MKP家族的一员，在炎症反应中起关键作用。MKP-1作为MAPK的一个负调控因子，可以使MAPK去磷酸化从而失活。既往研究发现，健康小鼠肺组织中p38 MAPK和MKP-1低表达或不表达，在炎症刺激作用下表达有上调[8]。MKP-1基因敲除小鼠的巨噬细胞由于MAPK活化增加而在体外显示对GC的抗炎反应降低。早前Abraham等[26]发现SRA与SSA患者肺泡巨噬细胞p38 MAPK的激活程度有差异。与SSA患者相比，SRA患者的PBMC中p38 MAPK的激活明显增加[27]，有研究将MKP-1定为体外对皮质类固醇治疗反应的标志物[28]。Milara等[29]在最近研究中观察到SRA患者的中性粒细胞和支气管上皮细胞中MKP-1表达较SSA降低。SRA患者使用GC后肺泡巨噬细胞中MKP-1表达显著降低，这与通过p38 MAPK途径使GC受体磷酸化，导致肺泡巨噬细胞MKP-1表达明显减少，从而降低了GC受体向细胞核内转移以及与细胞核DNA结合的能力有关。

3.1.4SRA与1,25-二羟维生素D Zhang等[30]将11例SRA患者和8例SSA患者的外周血细胞用1,25-二羟维生素D预孵育，然后给予地塞米松治疗和脂多糖刺激。通过流式细胞术，实时聚合酶链反应分析等方法分别检测单核细胞中脂多糖诱导的磷酸化p38，MKP-1 信使RNA的表达。结果发现维生素D在SRA患者和SSA患者的单核细胞中表现出抗炎和皮质类固醇增强作用。然而，SRA患者对皮质类固醇的反应强度仍显著低于SSA患者。一项研究证明1,25-二羟维生素D在抑制脂多糖诱导的p38 MAPK活化和促炎细胞因子产生的同时能刺激单核细胞MKP-1表达[31]。维生素D缺乏时p38 MAPK活化抑制或促进MKP-1表达的作用减弱，从而减少对GC的反应性。

3.1.5SRA与丝裂原和应激激活蛋白激酶1(mitogen and stress-activated protein kinase 1,MSK1) p38的下游存在MSK1，MSK1在不同的炎症基因启动子处刺激丝氨酸上的组蛋白H3的磷酸化以刺激炎症基因的转录。GC在激活炎症基因启动子时抑制活化的MSK1的募集，从而抑制NF-κB、p65交换以及组蛋白H3磷酸化。NF-κB是许多促炎细胞因子和免疫基因的主要调节因子(包括TNF-α、IL-8等)，在细胞受刺激时，NF-κB移位至细胞核并介导基因转录，它由DNA结合Rel蛋白家族的异二聚体或同二聚体组成[32]。GC受体可以通过抑制NF-κB来减少炎症。p38 MAPK激活后增强组蛋白H3磷酸化，使GC受体不能有效抑制NF-κB，影响NF-κB在炎症反应的各个阶段调控炎性介质的作用。此外，MSK1主要定位于细胞核，磷酸化的GC受体可以将磷酸化MSK1从细胞核转移到细胞质，从而抑制MSK1对其下游靶标的影响。

综上所述，NF-κB依赖性及其他炎症基因的过度表达，GC受体的过度磷酸化、受体对GC的结合亲和力及GC受体核转位减少，组蛋白H3磷酸化会降低GC的抗炎作用，引起对GC受体治疗的抵抗性，而以上过程均有p38 MAPK途径的参与。

3.2p38 MAPK抑制剂在SRA中的作用 激素抵抗是哮喘治疗中的重大挑战，一般SRA对GC受体的治疗无效，治疗通常以支气管扩张药物和其他免疫调节药物等为主。随着人们对p38 MAPK的研究及认识的加深，发现通过使用p38 MAPK抑制剂可改善SRA患者对皮质类固醇的敏感性，也可治疗许多其他疾病，如动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、抑郁症、免疫疾病等。

第一代p38 MAPK抑制剂以吡啶基咪唑抑制剂SB203580为代表，在小鼠哮喘模型中能够抑制过敏原诱导的TNF-α的增加，但在致敏小鼠中不能抑制卵清蛋白诱导的嗜酸粒细胞增多或中性粒细胞增多[33]。Laufer等[34]发现哮喘患者支气管上皮中黏蛋白5AC分泌量增多，p38 MAPK信号通路在黏蛋白5AC合成过程中的重要作用，阻断该通路可防止气道黏液高分泌。但是，体外SB203580处理不仅对巨噬细胞功能有抑制作用，还具有肝毒性和致癌可能性[35]，因此不再用于p38 MAPK抑制研究，从而开发出具有更高效力和选择性的第二代化合物SB239063。与SB203580相比，SB239063对p38 α、p38 β的选择性和效力的提高，对γ和δ没有抑制活性。相比没有加SB239063，SB239063能在小鼠哮喘模型中使卵清蛋白致敏的小鼠中气道嗜酸粒细胞增加量减少93%[36]，还显著降低了过敏原诱导的Th2细胞因子和卵清蛋白特异性IgE的增加。p38 MAPK抑制剂在抑制促炎症细胞因子的同时也可能抑制关键的抗炎蛋白，如三睾丸素的表达。三睾丸素是一种RNA结合蛋白，可促进许多蛋白质信使RNA的衰变，包括那些在慢性呼吸道疾病中起作用的蛋白质。p38 MAPK抑制剂有望用于目前可用的SRA药物的附加治疗[5,37]。p38 MAPK抑制剂具有比GC受体更广泛的抗炎作用，与GC受体可能产生协同效应。此外，p38 MAPK抑制剂甚至有望恢复SRA患者中的皮质类固醇敏感性。

4 结 语

SRA发病机制复杂，仍然是哮喘研究中的难点。p38 MAPK在SRA发病中起着重要作用，p38 MAPK抑制剂可以增强细胞对GC受体的反应性，甚至可以逆转激素抵抗。p38 MAPK直接或间接参加调节体内许多生理反应过程。p38 MAPK抑制剂可以作为恢复GC受体敏感性的新策略，但是抑制p38 MAPK通路在减轻激素抵抗，增强细胞对GC受体的反应性的同时，存在一些潜在的药物安全性问题，因此安全性、选择性更高的p38 MAPK抑制剂，能为SRA患者诊疗带来新的方向。