NOX4相关信号通路在肝纤维化发病机制中的作用

罗方云综述，黄晨恺，朱 萱审校

0 引 言

肝纤维化是肝对各种慢性损伤发生修复反应的动态过程，其主要以细胞外基质（extracellular ma⁃trix，ECM）过度沉积为特点，肌成纤维细胞（myofi⁃broblasts，MFB）的迁移是ECM的主要来源，且活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）在形态和功能发生一系列改变后将转化为MFB，故HSCs的活化是肝纤维化的中心环节［1-2］。大量研究证实还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nico⁃tinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）介导的氧化应激与肝纤维化的发生发展密切相关，而其亚基NOX4产生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）及其介导的相关信号通路引起HSCs的持续激活、ECM的形成、肝细胞的凋亡及MFB的迁移等促进肝纤维化的形成起了关键作用［3］。因此阐明NOX4相关信号通路在肝纤维化发病机制中的作用将为临床肝纤维化的治疗提供理论依据。

1NOX家族及其亚型NOX4

NOX是最早发现于吞噬细胞中的一种多亚基跨膜酶复合体［4］。其主要利用NADPH将电子传递给氧分子，从而产生超氧自由基及活性氧。NOX家族主要包括7个亚基，分别为吞噬细胞型NOX2，非吞噬细胞型NOX1、NOX3、NOX4、NOX5及两个双重氧化酶Duox1和Doux2，均具有一定的组织特异性［5］，其中NOX4是NOX的催化性亚基中分布最广泛的一种，且相较于其他NOXs的同工酶有其独特的特点［6］。NOXs的激活通常需要胞质内的亚基（p40phox、p47phox、p67phox、小 RhoGTP 酶、Rac1/Rac2）迁移至细胞膜与p22phox/NOX2异二聚体相互作用，而NOX4的活化并不需要以上细胞质内亚基的存在，仅需胞质调节亚基p22phox的募集［7］。研究发现，NOX4在肝损伤及之后的纤维化过程中起着更为广泛的作用。NOX4在肝细胞及HSCs中高度表达，且活化的HSCs中表达更加明显。在胆管结扎致肝纤维化的大鼠模型中，NOX4的表达与造模时间呈正相关，且胆管结扎再通后，NOX4的升高趋势受到抑制［8］。在慢性丙型肝炎病毒（chronic hepatitis C virus，HCV）患者中，NOX4的上调较其他NOXs更为显著，且NOX1未见任何变化［9］。在血管紧张素II（angiotensinII，AngII）刺激的HSCs中，内源性干扰NOX4表达后抑制了AngII对细胞中线粒体ROS的诱导作用，阻止了HSCs的活化及胶原生成［10］。由此表明NOX4在肝纤维化过程中扮演了重要角色。

2NOX4介导ROS致肝纤维化作用

氧化应激是指机体遭受各种有害刺激时，体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量的活性氧自由基和活性氮自由基从而引起细胞和组织的生理与病理反应［11］。在生理状态下，ROS作为正常代谢产物参与正常细胞的增殖、分化和凋亡；但在病理状态下，ROS过量产生则会导致氧化应激，其可通过多种机制损伤细胞的结构和功能，如直接氧化细胞组分，导致脂质过氧化或激活细胞内氧化还原信号通路，促进细胞凋亡等，参与多种疾病的发生与发展［12］。大量研究证实，在乙醇、病毒感染、血吸虫感染、慢性胆汁淤积、CCL4诱导慢性肝损伤的发病过程中都存在着氧化应激作用［13］。近年来研究发现，NOXs是ROS主要来源之一，且NOX4介导的ROS在肝纤维化的发生发展中起着重要作用［14］。Weyemi和Dupuy等［15］认为位于人各类细胞的核膜中NOX4产生的ROS可对细胞核内DNA产生氧化损伤，促进细胞凋亡，且NOX4对人类基因组具有不稳定性。ROS可促进组织纤溶酶原激活物抑制剂⁃1（plasminogen activator inhibitor⁃1，PAI⁃1）的表达，而PAI⁃1的过度表达可导致胶原在受损的肝组织中过度沉积，ECM降解减少，最终导致肝纤维化的形成［16］。各种细胞因子、生长因子、介质等，如血小板源 性 生 长 因 子（platelet⁃derived growth factor，PDGF）、AngII、瘦素、及吞噬细胞凋亡小体可上调HSCs内的NOX4，产生大量ROS，直接诱导HSCs活化，或触发TGF⁃B/Smad信号通路、ERK1/2信号通路、JAK/STAT信号通路等促进HSCs合成金属蛋白酶组织抑制剂（metalloproteinase tissue inhibitors，TIMPs）并抑制基质金属蛋白酶⁃1（matrix metallopro⁃teinase⁃1，MMP⁃1）基因的表达，从而导致胶原沉积，促进肝纤维化的发展［17］，产生的ROS还可通过P38和JNK信号通路促进核因子⁃κB（nuclear factor⁃κB，NF⁃κB）的激活，或通过氧化还原修饰使AKT和MAPKs磷酸化，增强核转录因子激活蛋白⁃1（nucle⁃ar transcription factor activation protein ⁃1，AP⁃1）的DNA结合活性，诱导炎性细胞因子的表达以介导肝炎症，促进肝纤维化的发展［18］。此外，NOX4也可通过抑制肉毒碱棕榈酰基转移酶1A进而增强脂肪酸氧化途径，促进NLRP3炎症小体的活化及其下游相关因子的表达，间接引起HSCs的活化及体内炎症级联反应，促进肝细胞损伤，肝纤维化的发生与发展［19］。Brenner等［20］发现 NOX4 抑制剂 GKT137831可阻断AngII、LPS和PDGF刺激的HSCs内ROS的表达，导致HSCs内的趋化因子基因及增殖基因表达下降，且同时在动物体内发现CCL4处理的NOX4基因敲除小鼠较野生型小鼠具有更轻肝损伤及肝纤维化程度，表明NOX4低表达可通过抑制炎症和增殖信号传导来防止HSCs活化。目前抗氧化剂无法对抗与氧化应激相关的疾病，可能是由于抗氧化剂与ROS相互作用失衡导致效果不明显，相反，在肝纤维化过程中，阻断ROS来源的酶类⁃NOXs可能是解决问题的关键，而NOX4可能是NOX家族中较好的治疗靶点［21］。

3 NOX4通过TGF⁃β/smad信号通路参与肝纤维化

大量研究表明，TGF⁃β亚族参与了细胞的生长分化、肿瘤发生和损伤修复等多种生物学效应，且以Smad依赖形式参与多种纤维化的形成，其中TGF⁃β1为肝纤维化进程的关键执行者，主要介导HSCs的激活及肝细胞的凋亡［22］。NOX4介导的肝纤维化主要通过TGF⁃β1/Smad2/3信号通路起作用。Fabre⁃gat等［23］发现TGF⁃β1介导的HSCs活化及肝细胞的凋亡依赖NOX4产生的ROS，且NOX4的调节主要发生在转录水平；在人肝细胞中也观察到TGF⁃β1上调NOX4，与肝细胞凋亡同时发生，siRNA靶向敲除NOX4减轻了TGF⁃β1诱导的凋亡。Pan等［24］表明在慢性砷中毒诱导肝氧化导致的肝纤维化小鼠中，抗氧化剂⁃GSE或NOX4 siRNA阻断了砷诱导的ROS产生，且观察到GSE呈剂量依赖性地抑制TGF⁃β1表达及其诱导的Smad应答元件P3TP⁃Lux的反式激活，降低了Smad3表达及TGF⁃β1诱导的Coll⁃I和α⁃SMA mRNA的表达。Sancho等［25］通过分析HCV患者和各种肝疾病的动物模型的肝组织基因表达发现，NOX4表达增加伴随着肝纤维化的形成及TGF⁃β途径活化，且体外TGF⁃β处理HSCs诱导的NOX4表达与静止型HSCs向MFB转化密切相关，敲除NOX4可抑制TGF⁃β诱导的静止型HSCs向MFB转化，但并不抑制TGF⁃β及其受体的表达，也不影响Smad2/3的磷酸化水平，表明在HSCs活化过程中，NOX4为TGF⁃β/Smad信号通路的下游分子。Ikeda等［26］也发现，在人类HSCs中，多烯磷脂酰胆碱正是通过抑制TGF⁃β1诱导的NOX4及ROS而发挥抑制HSCs活化功能。由此表明，NOX4介导ROS的产生与TGF⁃β/Smad信号通路密切相关，是促肝纤维化的一条关键通路。

4 TLR4/NOX4信号通路参与肝纤维化

迄今为止，TLR家族在哺乳动物中发现至少有13个成员，其中TLR4不仅是介导外源性LPS配体应答的最主要受体，还能结合机体自身产生的一些内源性分子，从而激活机体产生免疫应答［27］。最新研究表明TLR4介导的NOX4信号通路参与了肝组织的病理反应。Singh等［28］研究发现在LPS处理的人体肝细胞及野生型小鼠体内，NOX4、TNF⁃a、PC⁃NA表达上调，促进了肝细胞异常增殖及小鼠肝的炎症反应，而在NOX4基因敲除小鼠及siRNA靶向敲除NOX4的人体肝细胞中抑制了该现象的发生。肝纤维化进程中NOX4介导的LPS⁃TLR4信号主要通过NF⁃κB及AP⁃1途径起作用。活化的NF⁃κB诱导炎症细胞因子的释放及抑制凋亡基因表达来促进肝内炎症反应并参与肝细胞癌的发生［29］；而体内的细胞因子、纤维连接蛋白等可通过激活MAPK及JNK途径，刺激活化的HSCs中AP⁃1的活性，使c⁃jun或c⁃jun同二聚体、c⁃fos异二聚体等表达增强，诱导TIMPs的合成，抑制 ECM的降解［30］。Bataller等［31］研究也证实AngII可通过刺激HSCs内的 AP⁃1的DNA结合活性，诱导肝纤维化发生。Singh等［28］发现在LPS刺激的肝细胞中，NF⁃κB及AP⁃1受体表达增加，且P65蛋白及ERK1/2磷酸化水平也升高，而NOX4 siRNA处理阻止了该现象的发生。同样，有实验验证了LPS处理的细胞中，TLR4介导NOX4产生大量ROS，诱导了NF⁃κB的活化及其下游的炎症因子如IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃a的表达，而在同样坏境下TLR4 siRNA或NOX4 siRNA靶向干扰抑制了NF⁃κB激活及其下游炎症因子的表达［32］。也有研究表明由LPS诱导的肝损伤，其作用机制大多与上调TLR4⁃NOX4⁃NF⁃κB信号通路中TLR4 mRNA、NOX4产生的ROS及NF⁃κB p65蛋白磷酸化水平、增加促炎因子IL⁃6表达等过程有关［33］。由此可见，TLR4介导的NOX4信号通路在肝纤维化的发生发展中起重要作用。

5 NOX4/NLRP3信号通路参与肝纤维化

NLRP家族有NLRP1～NLRP14等14个成员，NLRP分子激活后与衔接分子ASC及效应分子pro⁃caspase⁃1形成炎症小体［34］。其中NLRP3炎症小体被研究的最深入。NLRP3炎症小体可感受细胞内的危险信号分子，特别是细胞内大量生成的ROS，NLRP3活化聚集并裂解caspase⁃1前体形成其活化形式，诱导细胞凋亡，同时活化的caspase⁃1又以蛋白水解的方式裂解炎症介质IL⁃1β和IL⁃18前体，促其活化，诱发组织内炎症反应［35］。目前NLRP3炎症小体参与了酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、HCV、血吸虫性肝病、药物及缺血再灌注损伤性肝病的病理过程已被证实。最新研究发现NOX4介导的NLRP3信号通路在肝纤维化的进程中起了重要作用。Zhang等［10］在体内、体外实验中发现，AngII可促进NOX4高表达进而激活NLRP3炎症小体诱导EMT形成，且该过程可被NLRP3siRNA、NOX4siRNA所阻止；Ang⁃（1⁃7）正是通过阻断NOX4 衍生的 H2O2激活的NLRP3炎性小体/IL⁃1β/Smad通路来抑制AngII或胆管结扎所致的肝纤维化。也有研究报道，NOX4介导的脂肪酸氧化诱导NLRP3炎症小体及其下游因子IL⁃1β的活化与胰岛素信号传导功能障碍密切相关，进而引起肝内代谢紊乱，诱导肝纤维化的发生与发展［36］。研究表明新生血管的形成是肝纤维化的一个重要病理特征，其中氧化应激是新生血管形成的关键因素。Wang等［37］发现芦丁可通过抑制NOX4⁃ROS⁃NLRP3信号通路降低肝内血管内皮炎症，调节血管内皮功能，抑制胞外基质的改变，降低肝纤维化的程度。综上表明NOX4介导的NL⁃RP3在肝内的炎症损伤引起的肝纤维化方面起重要作用。

6 NOX4相关的其他信号通路参与肝纤维化

NOX4可通过各种细胞信号通路参与肝纤维化的发生、发展，其机制复杂且相互影响。目前除以上陈述的比较明确的信号通路外，一些新兴的信号通路参与肝纤维化的发生发展与NOX4密切相关。Hedgehog信号通路的激活在诱导干细胞扩增、肝再生、促进炎性细胞聚集、肝损伤、血管重塑及肝纤维化的过程中起重要作用。Shh作为Hedgehog蛋白的重要编码基因之一，在HSCs的活化中扮演了重要角色。PDGF可通过AKT途径诱导HSCs表达Shh，进而促进HSCs中ROS产生，使用NOX4抑制剂可阻断ROS的产生及Hh信号通路的活化，抑制Hh诱导的EMT 形成［20，38］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）在肝纤维化过程中对NOX4起负性调控作用。黄连素可通过活化AMPK途径抑制NOX4的表达改善肝纤维化［39］。然而，NOX4相关信号通路除以上促肝纤维化发生发展外，在肝生长代谢方面有一定的改善作用。研究发现机体在受到损伤、感染、炎症刺激时一方面可有诱导肝细胞内NOX4产生大量ROS，活化NF⁃κB，引起IL⁃6的释放，促进肝的进一步损伤，IL⁃6也可通过Smad4或JAKs途径诱导铁调素的表达，调节铁代谢紊乱；另一方面，肝细胞内NOX4产生的H202可促进STAT3蛋白磷酸化，使STAT3进入细胞核，直接与铁调素基因启动子相应位点结合，促进铁调素的表达，改善铁沉积性肝纤维化［40⁃41］。生长激素通过激活转化生长因子STAT5诱导ROS生成酶NOX4基因的表达，促进凋亡因子Puma、Bim的激活，控制细胞外基质的异常增生，诱导HSCs的凋亡，阻止肝纤维化的进展［42］。

7 结 语

综上所述，NOX4在肝损伤致纤维化过程中具有十分重要作用。NOX4作为细胞主要产生ROS的酶类，可通过ROS进一步激活细胞内多种信号通路，如TGF⁃β/Smad、TLR4、NLRP3、Hedgehog、MAPK等通路激活调节肝内细胞的增殖、分化、代谢，对肝纤维化的发生发展起至关重要的作用。因此，阻断NOX4及其产生的ROS介导的信号通路对抗肝纤维化具有重要意义，但完全抑制NOX4活性可能影响细胞的正常生长、分裂、分化过程，这值得我们进一步研究，同时也为研发新的抗肝纤维化药物应用于临床提供一定的理论基础。