慢性肾脏疾病晚期患者的尿代谢组学特征分析*

冯 琴，尚小玲，李 智，胡 芳

(1.鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)医学检验科，湖北黄石 435000；2.澳门大学健康科学学院，澳门 999078)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的发病率显著上升已成为我国和其他国家一个严重的公共卫生问题[1，2]。根据肾小球滤过率(eGFR)的变化可以将CKD分为五个阶段，最近的研究表明，同时监测eGFR和蛋白尿能够准确地反映CKD的病情进展[3]。一般来说，临床医生基于血清肌酐中eGFR的值来判断是否为CKD。血清肌酐受肌肉质量、年龄、种族和早期评估的影响，另外当eGFR的值超过60 ml/min时再用这种方法评估并不准确[4]。一些新的分析物如中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C也发现与CKD进展有关，但是以往的研究多是建立在有限的研究对象基础上，而且各研究中采用的诊断标准及方法的不同造成了诊断效能评估等结果的差异[5]。因此需要发掘新的生物标志来识别CKD患者甚至识别早期CKD阶段，并最终被用来监测疾病的进展。

实验中运用NMR和MS的方法对CKD患者和健康人尿液进行非靶向分析，检测结果发现一些潜在的重要代谢物，具体研究如下。

1 材料和方法

1.1 研究对象 CKD患者的尿样收集来自鄂东医疗集团黄石市中心医院。收集31例(15例对照组和16例患者)的尿液用于探索阶段，另收集30例(15例对照组和15例患者)用于验证阶段。招募5例CKD(3～5期)的患者和7例新的健康受试者用于双盲实验。CKD阶段(3～5期)被定义为GFR值高于30 ml/min/1.73 m2。验证阶段对照组无糖尿病史、高血压、肾脏或炎症性疾病，没有接受任何已知的药物来干扰研究的变量，并根据性别和年龄与患者组相匹配。

1.2 主要仪器和试剂 NMR检测在华中科技大学进行，仪器型号为AVANCE400MHZ。液相色谱-三重四极杆质谱仪，型号为安捷伦6460 QQQ MS(6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer)，液相色谱系统由一个脱气装置，两个二元泵和恒温自动进样器组成(1200系列，安捷伦科技，帕洛阿尔托)。实验由上海爱博才思分析仪器贸易有限公司完成。恒温反相色谱柱型号为Atlantis T3(3 mm，2.1×100 mm2)，购自Waters公司。冷冻离心机(75002430)购自ThermoFisher。本实验中所用试剂，甲酸、乙腈、乙酸等均购自美国Sigma公司。

1.3 标本采集 收集所有患者的晨尿，并于13 000 r/min，4℃下离心15 min，去除细胞碎片，保存上清，并保存于-80℃直到分析。液相色谱实验：将10 μl样品注射进样于40℃恒温的反相色谱柱中。使用乙腈溶液进行梯度洗脱，洗脱速率为0.4 ml/min：0%的B液5 min，0～10%的B液2 min，10%的B液3 min，10%～80%的B液20 min左右，80%～100%的B液0.5 min，最后使用100%B液洗脱5 min(B液为0.1 ml/dl甲酸的乙腈溶液)。质谱仪在正离子模式下运行，气源温度为325℃，源气流量为11 L/min。每种代谢物的裂解电压在130～175 V范围内，保留时间固定为50 ms，电子倍增器电压为400 V。

1.4 统计学分析 运用 SPSS11.0统计软件对数据进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。健康人群按年龄和性别分组，分别计算各组代谢物的均值与标准差，应用方差分析比较不同年龄段对数据的影响。相关分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。主成分分析(PCA)和PLS使用AMIX软件。非参数Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验使用Dunn的多重比较测试应用于数据。

2 实验结果

2.1 质谱分析 本研究分为两部分，质谱分析和预测准确率。所有尿液样品来自不同的病人和对照组。主要是通过NMR分析了来自15例患者和15例健康人的尿代谢组，并进行了主成分分析(PCA)检验，继续运用液相色谱-三重四极杆质谱法分析来自另外16例CKD患者和15例对照的尿液样本进行验证。来自CKD患者的31例尿样和健康受试者通过1H NMR分析。根据图谱的峰值对每个样品进行PCA和偏最小二乘分析，结果显示各组患者代谢物的差异与年龄、药物、性别或样本无关，而主要是与CKD有关。因此，在探索阶段运用NMR技术鉴定了29种代谢物可以作为鉴定CKD的潜在生物标志，并且每种代谢物在所有募集者中全部被检测到。为了进一步评估29种代谢物在评价和预测CKD的有效性，实验采用了更高分辨率的技术，即选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)技术，对得到的结果进行定量分析见表1。表1显示这七种尿代谢物在CKD患者和正常人中存在显著的差异，其中明显与CKD相关性的是谷氨酸、胍基乙酸酯、α-苯乙酰谷氨酰胺和N-氧化三甲胺(在CKD中均增加)，以及5-羟脯氨酸、牛磺酸和枸橼酸盐(在CKD中均降低)。

表1在CKD和非CKD患者中有显著差异变化的数据

代谢物CKD+ vs 对照变化值P值 CKD- vs 对照变化值P值枸橼酸盐鸟苷酸乙酸酯牛磺酸N-氧化三甲胺谷氨酸α-苯乙酰谷氨酰胺5-羟脯氨酸0.025 87.5490.4364.242.4531.7340.1440.000 20.000 60.0240.000 40.000 50.000 60.000 2 0.0936.002 50.5933.4232.111.8360.1660.000 90.000 10.034 30.000 20.000 10.007 10.000 1

2.2 预测准确率 本研究中利用质谱分析结合选择反应监测技术，鉴定了CKD患者正常人尿液中有七种代谢物具有显著性差异，根据检测这些代谢物的变化趋势能够判断是否患有CKD。为了验证这些代谢物在鉴定CKD患者中的作用，本研究进行了盲性实验。通过募集CKD患者和正常人，检测他们尿液中这七种代谢物的含量，预测他们是否为CKD患者或者正常人。实验结果显示，根据对所收集样本的代谢物分析发现，5例CKD患者中有4例被鉴定为CKD患者(80%准确性)，7例健康人中有6例被划分到对照区(86%准确性)。这些结果说明本研究中鉴定的七种代谢物谷氨酸、胍基乙酸酯、α-苯乙酰谷氨酰胺、N-氧化三甲胺、枸橼酸盐、5-羟脯氨酸和牛磺酸作为鉴定CKD的生物标志物具有较高的可靠性。

3 讨论

目前，我国CKD发病率呈升高趋势，其原因是缺乏特异度高的早期诊断方法。过去用来检测CKD患者主要是通过检测eGFR和蛋白尿的含量。但是eGFR受肌肉质量、年龄、种族和早期评估的影响，并不能十分准确地反映出CKD患者进展阶段。尽管后来的研究鉴定了如中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C也与CKD进展有关，但是这些研究仅仅建立在非常有限的研究对象基础上，而且不同的研究中采用的诊断标准及方法也会造成诊断效能评估等结果的差异。质谱检测技术可以大规模高通量筛选代谢物，具有高特异度和灵敏度，且可将传统方法检测不到的化合物检出。然后，再用LC-MS技术将患者和正常人的质谱图进行定量分析，以鉴定尽可能多的具有差异的代谢物信息和鉴定新的生物标志物。其优势在于：能够直接检测分析患者的原始样品，灵敏度高，特异度好，所需样品数量少；分析简便，高通量大规模筛选；结果可靠，重复性好。在本研究中，通过质谱检测对比CKD晚期阶段(3～5期)患者和健康志愿者的尿液代谢物，发现了CKD患者尿代谢物中有七种代谢物可以明显表征CKD。

根据文献报道几型肾脏损伤中转录组数据显示5-羟脯氨酸酶上升22%，而γ-谷氨酰转移酶的表达降低[7]，这些数据变化与本研究中显示的数据一致，在CKD患者尿液中5-羟基脯氨酸降低而谷氨酸升高。苯乙酰谷氨酰胺在肝脏和肾脏中由苯乙酸酯和谷氨酰胺合成并通过尿液排泄体外。苯基丁酸酯和苯乙酸酯在患有尿素循环障碍的患者被用作氮循环的替代途径，因此苯乙酰谷氨酰胺作为有效的替代载体可以降低这些患者的氮水平[8]。在CKD患者中，由于肾脏功能下降导致尿素积累，这可以解释在CKD患者中苯乙酰谷氨酰胺的增加，作为氮排泄的补偿机制。牛磺酸能偶促进一些离子的转运如钠离子、钾离子、钙离子和镁离子，有研究表明在高血压和肾衰竭患者血浆中的牛磺酸降低，这也与本实验发现CKD患者中低牛磺酸相一致[9]。N-氧化三甲胺在肾衰竭患者中上升，在本研究中同样发现在CKD患者中N-氧化三甲胺上升[10]。由于肾功能下降导致尿素和胍增加，而N-氧化三甲胺是机体用来抵消这些物质。实验中发现CKD患者中枸橼酸盐水平降低[11]。与前人的发现一致。此外，几种代谢紊乱与低枸橼酸盐相关，包括肾小管pH或细胞内pH降低，例如CKD患者特别是晚期阶段存在的代谢性酸中毒[12]。

此外，利用本研究中鉴定的其中代谢物预测CKD患者和正常人，其中CKD患者准确性达到80%，正常人的准确性高达86%，仅仅只有两例预测错误。表明这7种生物标志物不仅仅可以用于正常人CKD的诊断，更具有意义的是可准确判断CKD。因此，我们认为本研究中鉴定的7种代谢物可以作为判定CKD的标志物，有助于识别和监测CKD的进展阶段。