急性髓系白血病患者外周血粒细胞、单核细胞膜GPI锚链和红细胞表面CD59表达水平的研究*

范臻佳，金丽兰，史 册，刘 禹，蔡 刚

(上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025)

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是克隆性造血干细胞疾病的一类，是髓系造血干/祖细胞的恶性疾病。以骨髓和外周血中原始和幼稚的髓性细胞增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染、发热、脏器浸润和代谢异常等，发病早期部分症状与阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)的部分临床表现较为相似，特别是血管内溶血的相关表现[1]。这可能与AML患者外周和骨髓异常血细胞缺乏相关膜锚链蛋白有关。众所周知，PNH是以膜锚链蛋白CD55和CD59缺乏致血管内溶血为主要病理特征，其本质是造血干细胞的GPI锚链合成障碍，导致包括CD55和CD59在内的多种血细胞膜锚链蛋白缺乏。目前已有一些证据表明AML患者外周异常血细胞也存在CD59等相关膜锚链蛋白缺乏，但其是否也存在GPI链的缺乏，以及其表现是否与典型PNH相同，尚不清楚。嗜水气单胞菌溶素变异体(fluorescent-labeled aerophilic plasminogen，FLAER)是一种可与GPI锚链特异性结合的物质[2]，目前，通过流式细胞术采用荧光标记的FLAER及膜锚链蛋白的单克隆抗体检测GPI锚链及其锚定蛋白的缺乏是国际临床流式细胞协会(international clinical cytometry society，ICCS)和欧洲临床细胞分析学会(european society for clinical cell analysis，ESSCA)推荐的对患者粒细胞和单核细胞进行PNH克隆诊断的确诊方法[3]。ICCS/ESSCA也同时推荐检测红细胞表面CD59的表达水平，判断其是否存在CD59部分缺陷(II型细胞)或完全缺陷(III型细胞)的细胞[4，5]。通过有核细胞与红细胞共同确定患者是否存在PNH克隆。

基于ICCS/ESSCA推荐的PNH检测方法，我们拟在本研究中，采用流式细胞术对不同类型的AML患者进行外周血红细胞CD59和有核细胞FLAER检测，同时以确诊的PNH患者作为对照，分析AML患者是否存在FLAER阴性的类PNH克隆及其特点。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集瑞金医院2014年～2018年门诊和住院患者57例，确诊为PNH患者21例(其中伴有再生障碍性贫血的5例，男性8例，女性13例)；AML患者36例(其中M2 3例，M3 21例，M4 5例，M5 7例；男性17例，女性19例)。

1.2 仪器和试剂 美国BD公司CantoII流式细胞仪，anti-CD59- FITC，FLAER-ALEXA488，anti-CD33- APC，anti-CD14- Pacific Blue，anti-CD24- PE，anti-CD45-PC5等荧光标记流式抗体及溶血素等均购自BD Pharmingen。

1.3 方法

1.3.1 外周血粒细胞和单核细胞FLAER检测 根据ICCS/ESSCA指南，基于CantoII平台，采用五色流式细胞术检测。避光孵育30 min后加入溶血素裂红，完全溶血后加入PBS洗涤细胞，并上机检测，从而得到目的细胞亚群的百分数。正常参考范围：CD24-FLAER-细胞/CD45+粒细胞<1%，CD14-FLAER-细胞/CD33+单核细胞<1%。

1.3.2 外周血红细胞CD59检测：根据ICCS/ESSCA指南，基于CantoII平台，采用单色流式细胞术检测。将荧光素标记的各种单克隆抗体加入到洗涤红细胞中，与细胞膜上相应的抗原结合，孵育后再次洗涤、重悬等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到表达缺陷细胞的百分数。正常参考范围：II型细胞和III型细胞比率均<1%。

2 结果

2.1 红细胞CD59的表达水平 见图1。AML组患者未检出明显的CD59表达缺陷的细胞，PNH组患者进行检测后CD59抗原表达出现不同程度缺失，AML组患者检测结果与PNH组相比，各型红细胞比例差异均有统计学意义(t=3.41～6.43，均P<0.001)。

表1 AML组和PNH组外周血细胞抗原缺失率

图1 健康对照、AML及PNH患者红细胞CD59流式比较

2.2 粒系和单核系 见图2。AML组患者和PNH组患者进行检测后粒细胞和单核细胞均出现了GPI双阴性的缺失细胞。但AML组患者的缺失细胞的克隆比例与PNH组患者相比，差异具有统计学意义，结果见表1。同时，可在AML患者中检出不同数量的FLAER单阳性细胞，例如CD24-FLAER+的粒细胞和CD14-FLAER+单核细胞。

图2 健康对照、AML及PNH患者粒细胞、单核细胞FLAER流式比较

3 讨论

由于白血病细胞具有“异质性”和“非同步性”，常伴有抗原表达紊乱现象[6]，并且其分化发育各个阶段出现了不规律和调节紊乱，从而导致其膜抗原的表达异常[7]。既往已有研究发现，部分AML患者常伴有粒、单细胞的CD55或CD59缺陷，可能是导致这些患者并发血管内溶血的重要原因。众所周知，CD55和CD59是保护细胞免受异常补体激活杀伤的重要膜锚链蛋白[8]。AML患者这些CD55或CD59缺陷的细胞究竟是仅为膜锚链蛋白缺乏，还是也涉及糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI)锚链的合成障碍，尚不完全清楚。由于GPI锚链合成障碍会导致包括CD55和CD59在内的多种膜锚链蛋白缺乏，可能对AML患者血细胞的多种生物学功能产生影响。

在本研究中，我们的结果清晰的显示，尽管AML患者粒细胞、单核细胞检出的典型PNH克隆明显小于PNH患者，但勿庸质疑的是多种类型的AML病患都存在GPI膜锚链的合成障碍和/或锚链蛋白的缺失，不仅有典型的粒细胞、单核细胞PNH克隆出现，同时还存在不同数量的FLAER单阳性细胞，表明这些恶性干、祖细胞的相关抗原表达或蛋白合成明显紊乱，这也与既往文献报道AML患者粒细胞表面存在CD59表达异常的发现相一致[9]。值得注意的是，部分M3和M5患者均不仅有恶性细胞系的GPI锚链合成障碍，而且也存在其它有核细胞系的GPI锚链合成障碍，提示这部分患者骨髓的异常改变可能发生在造血细胞更原始的阶段。但是，我们在纳入的AML患者中未检出明显异常的CD59缺陷克隆，一方面间接提示了AML患者粒细胞、单核细胞的恶性改变未在DNA水平明显影响红系细胞的发展；另一方面，这也有助于鉴别诊断AML患者是否伴有PNH，因为典型的PNH患者都有明显的CD59缺陷的II型和/或III型细胞，表现为红系及有核细胞系的多系造血细胞GPI锚链合成障碍[10]。由于本研究中未纳入红白血病患者，因此未能对该类型患者的红系及有核细胞系进行评估，观察这类病人是否会同时出现红系和粒细胞、单核细胞系的GPI锚链合成障碍，这需要在下次研究中予以澄清。

通过本项研究，我们了解到粒细胞、单核细胞等有核细胞系GPI锚链合成障碍在AML患者中是一种常见现象，尽管检测到的锚链缺陷克隆小于典型PNH患者。由于GPI锚链具有重要的生物学意义，因此，其缺陷对AML等疾病的病理生理有何影响值得深入地进行研究；同时也表明，对AML患者检测粒细胞、单核细胞的GPI锚链水平对于判断病情及评估预后可能具有重要的临床意义。