向海地区绿头鸭体内1膜壳属(Hymenolepis spp.)绦虫的分离鉴定

刘 莹 李 杰 李秀云 王丽新 翟琪安 沈冬冬 彭智伟 侯志军*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.陕西佛坪国家级自然保护区管理局，佛坪，723400；3.哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨，150332)

绿头鸭(Anasplatyrhynchos)隶属于雁形目(Anseriformes)鸭科(Anatidae)鸭属，是向海地区一种常见的湖泊游禽，主要栖息于水生植物丰富的湖泊、河流、池塘、沼泽等水域中。绿头鸭冬季和迁徙期间也出现于开阔的水库、江河、沙洲和海岸附近沼泽和草地[1]。水禽体内寄生虫的种类繁多，不同地域不同鸟类感染寄生虫也不尽相同[2]。韩红玉等在上海(2013)调查发现鸟类肠道寄生虫检出率为 26.21%，以绦虫为主要优势种[3]。Hanno等在加利福尼亚北部的鸟类寄生虫的调查中发现了5种棘头虫，24种线虫，8种绦虫和27种吸虫，其中绦虫的感染率最高[4]。寄生于鸟体内的绦虫可引起鸟类的体重减轻或肠梗塞[5]。李大心等曾报道舌状绦虫导致一只正当繁殖季节的雄黑鹤肠穿孔死亡[6]。

由于形态学观察并不能完全有效的进行绦虫的种属鉴定，分子生物学方法被广泛用于寄生虫的分类研究[7]。如今，分子生物学在绦虫种类的鉴定上，已经有了一个较为广泛的应用。Greiman等在通过对28S rDNA基因的扩增，结合形态学数据创立了一个新属[8]。此外，Yang等利用线粒体基因cox1和ITS进行扩增来鉴定膜壳属绦虫(Hymenolepisspp.)[9]，总之，已经有越来越多的将分子生物学成功应用于一些绦虫种类鉴定的报道[10]。显然，膜壳科(Hymenolepididae)种属的鉴定需要形态学和分子生物学方法的结合使用[11]。

1 材料与方法

1.1 样品来源

绦虫取自吉林省向海地区的绿头鸭小肠内，取出绦虫后，置于70%～75%的酒精内保存，按照其宿主、寄生部位和采样日期进行编号，置于冰箱内，用于形态学和分子学的鉴定。

1.2 形态学鉴定

1.2.1 实验试剂：无水乙醇，丁香油，苏木素，中性树胶。

1.2.2 将绦虫样品进行测量并记录。绦虫虫体经苏木素染色制成标本后置于光学显微镜下观察其形态特征。

苏木素染色[12]：

1.2.2.1 压片：70%的酒精中压3～4 d。

1.2.2.2 洗脱：依次投入50%酒精(30 min)、30%酒精(20 min)、蒸馏水(10 min)中进行洗脱。

1.2.2.3 染色：将样品投入10倍稀释的染色液中染色12 h。

1.2.2.4 脱水：将样品依次投入30%、50%、70%酒精中各脱水30 min。

1.2.2.5 脱色：将样品投入1%的酸酒精中进行脱色8 min。

1.2.2.6 脱水：将样品一次投入梯度酒精中脱水，80%酒精(30 min)、90%酒精(30 min)、95%酒精(20 min)、100%Ⅰ 酒精(10 min)、100%Ⅱ 酒精(5 min)。

1.2.2.7 透明：将样品投入100%二甲苯中透明1～2 min。

1.2.2.8 封片：将样品置于载玻片上，用中性树胶固封。

1.3 分子鉴定

1.3.1 Biospin组织基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒(杭州博日科技有限公司产品、热稳定DNA聚合酶、DNA Maker、 Proteinasse K、DL2000T宝生物工程有限公司)产品。

1.3.2 DNA提取：在液氮中将虫体组织块研磨粉粹，使用组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取 DNA，-20℃下保存。

1.3.3 引物设计：cox1使用的引物参考Haukisalmi等设计的，目的片段长度为730 bp[13]。引物序列详细见表1。

1.3.4 PCR反应体系及反应条件

反应体系：PCR buffer 2.5 μL，MgCl22.0 μL，dNTP 2.5 μL，Primer1 1.0 μL，Primer2 1.0 μL，DNA 3.0 μL，蒸馏水 12.0 μL，Taq酶1.0 μL。

反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，30个循环；72℃终延伸7 min。

表1cox1基因扩增引物序列

Tab.1 Amplification of primer sequences of cox1

1.3.5 将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳下进行观察。

1.3.6 产物纯化、连接及转化

将纯化扩增产物进行胶回收(杭州博日科技有限公司的胶回收试剂盒)，将纯化后产物连接到PMD18-T载体上，16℃过夜。将连接产物转化至感受态细胞中，振荡培养后涂布在含 Amp的培养基上，过夜培养后挑选白色的单菌落，配制菌液，对菌液进行PCR鉴定，筛选阳性PCR产物被送到吉林省库美生物科技有限公司进行测序，并进行Blast比对分析，确定虫种。

1.3.7 序列比对及进化树构建(采用贝叶斯进行建树)

所测绦虫基因序列(Hymenolepisspp.mallard)与GenBank 数据库上的其他膜壳科绦虫的cox1序列采用贝叶斯发建立系统进化树。

2 结果

2.1 试验绦虫

采集日期：2015年10月2日

宿主位置：吉林省向海地区

检获数量：3条

模式样本正模(NEFU-HY1923)，存放于东北林业大学寄生虫研究中心，头节及部分节片经染色制片留存(3条)。

2.2 形态描述

小型绦虫，虫体全长为35 mm，虫体最大宽度为0.7 mm。

头节呈球形，直径范围为0.16～0.42 mm，平均为0.29 mm，具4个吸盘，吸盘为圆形，头节上有一个短而圆、可伸缩的顶突，顶突上有20～30个小钩，呈单环排列。

颈部较长而纤细。链体约由160个节片组成。所有节片均宽大于长并由前向后逐渐增大，

成熟节片：每个节片具有3个圆球形的睾丸，3个横列，1个靠生殖孔，2个在对侧，储精囊较发达。卵巢呈分叶状，位于节片中央。卵黄腺椭圆形，在卵巢和后方的腹面。

孕卵节片：0.15～0.30 mm×0.8～1.0 mm，所有节片生殖孔都位于虫体同侧。子宫呈袋状，其中充满虫卵并占据整个节片。

通过观察试验绦虫形态学特征；如小型绦虫(35 mm)，头节呈球形具有4个吸盘和1个短而圆、可自由伸缩的顶突。成节有3个圆球形的睾丸，位于节片的中部，排成一横列。可以确定该绦虫为膜壳属绦虫。

2.3 分子进化分析

Bayesian法构建的cox1序列的进化树结果见图1，进化树由所测绦虫基因序列(Hymenolepisspp.mallard)与GenBank 数据库上的其他绦虫的cox1序列建立系统进化树分析，以Arostrilepishorrida为外群基因，单独为一支，在进化树的上方，其他基因选自膜壳属，分别为：微小膜壳绦虫(Hymenolepisnana)、缩小膜壳绦虫(Hymenolepisdiminuta)、Hymenolepishibernia绦虫，微小膜壳绦虫单独聚在一支，缩小膜壳绦虫聚在一支，Hymenolepishibernia绦虫单独聚在一支，由进化树可见该试验绦虫为膜壳科膜壳属绦虫。

图1 绿头鸭体内分离的绦虫与其他膜壳绦虫cox1基因序列构建的进化树Fig.1 phylogenetic tree for cox1 gene sequences of Hymenolepis spp.isolates from mallard and other Hymenolepis spp.

3 结论与讨论

通过形态学观察和分子生物学方法分析，确定在绿头鸭小肠内发现的绦虫为膜壳科膜壳属的绦虫。

本次所鉴定野生绿头鸭寄生绦虫均采集自鸟的肠道，与绝大多数绦虫的寄生部位类似。在雁形目鸟类中，有17个属的膜壳科绦虫被发现[11]。但由于鸟类所处地域不同，环境多样化，物种为了适应其所处的生存环境，自身的结构会发生不同的变化以更好地生存。因此，不同的膜壳科绦虫有不同的形态特征，观察绦虫的形态结构是区分不同种绦虫最直接的方式。如有无吻钩，吸盘是否为锯齿状，睾丸的数量和卵巢的形状等形态学特征是鉴定绦虫的重要特征之一[14]。

在本试验的绦虫中，头节具有4个吸盘和1个短而圆、可自由伸缩的顶突，顶突上有20～30个小钩，排成一圈，根据这些膜壳属绦虫的典型特征，基本可以确认其的属阶分类。形态学的观察在寄生虫鉴定的方面是一种不可或缺的手段，但是有时单单依靠形态学的观察鉴定，并不能完全有效地区分物种[15]，例如，亚洲带绦虫和牛带绦虫，其形态几乎完全相同，因此长时间被认为是同一个物种，直到对其线粒体基因组测序后才发现它们属于两个不同的种。本实验采用扩增该绦虫的cox1基因建树补充鉴定该试验绦虫的种类，该绦虫和微小膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫和Hymenolepishibernia在进化树中各成一支，确认其为膜壳属绦虫，同形态学鉴定结果相同。

现已有报道的在绿头鸭体内寄生的绦虫有：片形遂缘绦虫(Fimbriariafasciolaris)、叉棘单睾绦虫(Aploparaksisfurcigera)、纤细幼钩绦虫(Sobolevicanthusgracilis)、冠双盔绦虫(Dicranotaeniacoronula)、Cloacotaeniamegalops绦虫、Diorchisparvogenitalis绦虫、Diorchisstefanskii绦虫、Microsomacanthusparacompressa绦虫、Schistocephaluspungiti绦虫、Aploparaksisfurcigera绦虫、膜壳科绦虫(Hymenolepididaesp.)[16-17]等。本试验在绿头鸭小肠内检测到的膜壳绦虫是首次在向海地区发现的。

本次所鉴定出的寄生虫为膜壳科膜壳属绦虫，该绦虫为向海地区绿头鸭小肠内首次检测，填补了我国向海地区野生鸟类寄生绦虫种类的空白。