缅甸蟒沙门氏菌的分离与鉴定

蒲文渊 郑继平* 曾纪锋 杨 诺 郭桂英 王 宇

(1.海南大学热带农林学院(生物学院)，海口，570228；2.海南大学热带农林学院(动物科技学院)，海口，570228)

缅甸蟒(Pythonbivittatus)属于爬行纲(Peptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)原蛇下目(Henophidia)蟒科(Pythonidae)蟒属，是潮湿雨林性的典型物种[1]。在东南亚和我国海南、西南、华南等地均有分布，因为缅甸蟒的蛇皮、蛇肉具有很高的经济价值和营养价值，近年来东南亚和我国海南地区人工养殖缅甸蟒逐渐兴起[2]。在养殖过程中，肺炎是一种严重危害缅甸蟒健康的常见疾病，一般是由于季节交替昼夜温差大缅甸蟒抵抗力下降病原菌引起肺部感染，最终因转为严重肺炎而导致缅甸蟒呼吸衰竭死亡[3-4]。感染性肺炎对海南人工养殖缅甸蟒造成了巨大的经济损失。

沙门氏菌(Salmonellaspp.)是一类常见的食源性致病菌。其能定居于机体内多个内脏器官，通过生殖系统和粪便能够垂直传播和水平传播，严重危害人和动物的健康。有研究发现，沙门氏菌是引发缅甸蟒感染肺炎的病原菌中非常重要的一类[5-6]。因此，对于患有肺炎的缅甸蟒进行病原沙门氏菌的分离鉴定及药物敏感性试验，在缅甸蟒肺炎的预防及治疗中具有重大意义。

2015年10月在海南文昌缅甸蟒养殖场出现4条发病蟒蛇，其出现呼吸困难、体表灰暗、无法蜕皮和体格消瘦的特征。解剖后发现肺部有大量浓稠炎性渗出物，气管被痰液堵塞。我们分别从4条缅甸蟒的肺部组织和血液中在无菌条件下进行病原菌的分离，通过革兰氏染色、生化特征检测和16S rRNA技术对所分离的细菌进行鉴定。以探究引起此次缅甸蟒感染肺炎的病原菌。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料采自海南省文昌缅甸蟒养殖基地的4条因患肺炎而死亡的人工养殖缅甸蟒，其中包括体重为15.2 kg的3岁雌性缅甸蟒(Python1)、体重为16.8 kg的3岁雄性缅甸蟒(Python2)、体重为11.0 kg的2.5岁雄性缅甸蟒(Python3)和体重为19.0 kg的2.5岁雌性缅甸蟒(Python4)。主要病理特征在肺部出现大量浓稠炎性渗出物，通过无菌采取心血和肺部组织样品。

1.2 主要试剂

无菌脱纤维羊血培养基购自上海广锐生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒购自南京建成科技有限公司；糖、醇类发酵试验培养基、尿素酶试验培养基、氨基酸脱羧酶试验培养基和商品化三糖铁琼脂培养基；细菌基因组提取试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、pXT19-T Vector、PCR产物纯化试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；常用药敏试纸，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离

无菌采集死亡缅甸蟒的心血和肺部组织分别接种于血琼脂平板，在恒温培养箱37℃培养24～48 h，观察细菌的生长状况，挑取形态一致的优势菌落进行划线培养，获得纯培养菌株。

1.4 细菌形态及理化特性鉴定

分别从4条缅甸蟒不同病样取分离纯化后菌株，画线接种于LB平板中，在37℃培养 24 h，观察细菌的生长情况和菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色，显微镜观察其形态；将纯化后的菌株参照《常见细菌系统鉴定手册》[7]，进行糖、醇发酵、赖氨酸脱羧酶、尿素酶和硫化氢实验。

1.5 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

参照基因组提取试剂盒所述方法，提取分离菌株基因组，以其为模板采用细菌16S rRNA的通用引物F：5′GGGATAACTACTGGAAACGGTA 3′/R：5′GAAGGCACTCCCGTATCTCTA 3′进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃3 min；94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30个循环；72℃10 min；PCR产物回收纯化后克隆至pXT19-T Vector中，阳性的重组质粒送华大基因公司测序。将分离菌16S rRNA测序结果在NCBI据库中进行核酸BLAST比对，利用MEGA 6.0软件进行序列同源性分析，通过Neighbor-Joining方法，构建系统进化树。

1.6 抗菌药物敏感试验

用纸片扩散法进行23种临床常用抗微生物药物的药物敏感性试验，将实验结果与美国国家临床实验室标准委员会(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)颁布的抗菌药物抑菌圈直径判断标准进行比对。

2 结果与分析

2.1 缅甸蟒临床解剖症状

在本研究中4条缅甸的临床症状基本相似，观察外部特征发现，蟒蛇精神沉郁、食欲减退、体表暗淡、无法正常蜕皮和呼吸困难等症状。在其口腔内出现气泡装黏液(图1：A)。呼吸时有啰音并有浓痰咳出。剖检后发现其呼吸道有乳白色痰液堵塞，在肺脏内发现浓稠炎性渗出物(图1：B)，4条发病蟒蛇的临床症状为典型的感染性肺炎。有研究表明，气温骤变对蟒蛇的健康影响很大，尤其是当气温降至10℃以下或者温度变化大于5℃时极易引起蟒蛇呼吸道疾病[5]，这可能是由于气温下降或骤变使蟒蛇免疫力下降导致呼吸道感染进而由感冒转变为肺炎，最终呼吸衰竭死亡。本次实验的缅甸蟒发病时间均在10月，此时正值海南秋季多台风昼夜温差大，气候和温度变化是引起蟒蛇肺炎的重要环境因素。

A：口腔内含有泡沫状黏液(箭头所示)A：There is foam mucus in the mouth(shown by arrow)

B：肺部充满乳白色浓稠炎性渗出物(箭头所示)B：The lungs are filled with milky white thick inflammatory exudates(shown by arrows)图1 缅甸蟒病理检查Fig.1 Pathological examination of python bivittatus

2.2 沙门氏菌的分离与鉴定

将患病缅甸蟒分别进行病理剖检，取肺组织和心血在血琼脂平板划线培养，均长出形态单一菌落，在LB培养基上的菌落形态为圆形、边缘整齐、表面光滑湿润、中央隆起、半透明、灰白色；革兰氏染色显示分离菌均为革兰阴性，菌体短小，多为单个排列，无芽孢、无荚膜杆。通过分离纯化我们分别从4条患病蟒蛇体内各取1株为代表，分别命名为P1、P2、P3和P4。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》方法[8]，对代表株进行糖醇发酵试验、赖氨酸脱羧酶试验、尿素酶试验、硫化氢试验等生化检测。实验结果显示(表1)：发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇产气，不发酵蔗糖和乳糖同时不水解尿素，4代表株均与肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)生化特征相符。

表1 缅甸蟒分离菌株生化特征

Tab.1 Biochemical characteristics of strains isolated frompython bivittatus

注：“+”阳性；“-”阴性

Note：“+”represents positive，“-” represents negative

对所分离株的16S rRNA基因经PCR扩增后获得的片段为1 500 bp，与预期大小一致(图2)。测序后在NCBI中使用BLAST，对4株菌的16S rRNA基因序列进行分析。比对结果显示：全部分离株与NR_044371.1Salmonellaentericasubsp.houtenaeDSM 9 221菌株同源性达到99%。因此，结合菌株的表型特征、生理生化特性鉴定与16S rRNA序列分析，可以认定4代表菌株为肠道沙门氏菌。

图2 16S rRNA基因PCR电泳图M：5 000 Marker；1.P1；2.P2；3.P3；4.P4Fig.2 Electrophoresis of 16S rRNA genes PCR amplified products

爬行动物是沙门氏菌的重要宿主，其中蛇类沙门氏菌的携带率较高，可能会对养殖者的健康构成威胁[9]。沙门氏菌包括两个种分别为S.enterica和S.bongori其中S.enterica又被分为6个亚种包括：enterica(formersubgeneraⅠ)，salamae(Ⅱ)，arizonae(Ⅲa)，diarizonae(Ⅲb)，houtenae(Ⅳ)和indica(Ⅵ)[8]。有研究报道，S.subspeciesenterica亚种主要宿主为恒温动物，其他亚种均主要发现于变温动物[10-11]。而且其中除了S.subspeciesindica亚种外，其他亚种均会感染人[10]。本次研究所分离的4株缅甸蟒肠道沙门氏菌均为houtenae(Ⅳ)亚种。爬行动物所携带的S.subspecieshoutenae亚种与儿童的感染有关，会引起儿童的脑膜炎[12]。研究发现，爬行动物所携带的沙门氏菌与其食物的来源有关[12]。海南文昌缅甸蟒养殖场的蟒蛇主要食物为鸡，禽类作为一种极易感染沙门氏菌的动物很有可能是导致缅甸感染沙门氏菌的主要原因[13]。因此，在缅甸蟒的管理和养殖过程中，我们应该对其食物来源进行检测。对于养殖人员应该做好相应的消毒防疫工作，避免感染沙门氏菌对身体健康造成危害。

2.3 沙门氏菌药敏实验分析

缅甸蟒沙门氏菌的防治还主要依靠抗菌药物，23种抗菌药物的药物敏感试验结果显示(表2)，4株沙门氏菌分离株对链霉素、头孢唑啉和磺胺异恶唑部分耐药；对氟罗沙星、复方新诺明和氧氟沙星等12种抗生素完全敏感，但其中卡那霉素、庆大霉素、头孢哌酮和妥布霉素抗菌药物在临床上对沙门氏菌无效。其耐药谱与报道的沙门氏菌药物敏感性基本相似[14]，但有的研究中发现沙门氏菌对萘啶酸的耐药性较高[15]。而本次实验中缅甸蟒沙门氏菌对萘啶酸敏感。导致这种现象的原因可能与养殖过程中抗生素的使用有关，在目前蟒蛇的养殖过程中一般不会使用抗生素，因此蟒蛇源沙门氏菌的耐药情况较少。体外药敏试验的结果可为缅甸蟒感染性肺炎防治提供一定指导依据，但由于蟒蛇饲喂的特点，药物的定时定量投给较为困难，抗菌药物的治疗效果并不理想，因此，加强对蟒蛇的饲养管理，依据实际情况对养殖环境温度适当调控，并对笼舍进行适当的换水及消毒，预防为主，治疗为辅，降低缅甸蟒的发病率，这对缅甸蟒养殖业的健康养殖甚为重要。

表2 缅甸蟒分离菌株药敏试验结果

Tab.2 Drug susceptibility test results of the isolates Python bivittatus

续表2

注：R：耐药；I：中度敏感；S：敏感；*：表示敏感性对应抗菌药物在临床上对沙门氏菌无效

Note：R：Resistance.I：Middle sensitive.S：Sensitivity.*：To indicate that the susceptibility to antimicrobial agents is not clinically effective againstSalmonella

3 结论

本次实验从肺炎缅甸蟒体内分离病原菌，通过细菌的形态特征、生化特性和16S rRNA基因鉴定，确定了所分离病原菌均为肠道沙门氏菌。与此同时，我们对此次分离的病原菌做了23中抗菌药物的敏感性实验。通过实验结果得到了氟罗沙星等13种药物对其敏感。本工作结果对海南缅甸蟒养殖过程中感染肺炎病因学研究及抗生素防治具有重要价值。