肉鸡MTHFD2基因的克隆和表达分析

魏 娟，戚 星，邢晋祎，徐 敏，孙炜涵

(临沂大学生命科学学院，临沂276000)

叶酸是指具有蝶酰谷氨酸结构的一类水溶性族维生素，普遍存在于各种动植物食品中，是人体和动物维持健康成长和发育的必需维生素之一。叶酸代谢途径在细胞增殖中发挥重要作用，该途径中所必需的酶一直是癌症治疗靶点的热门研究对象，其中MTHFD2基因(Methylene tetrahydrofolate dehydrogenase 2，亚甲基四氢叶酸脱氢酶2)逐渐成为研究热点。MTHFD2蛋白定位于线粒体，是一种双功能酶，具有亚甲基脱氢酶和环化水解酶双重活性，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依赖性酶，参与NADH的产生，能够催化由亚甲基四氢叶酸和NAD+产生N-10-甲酰基-四氢叶酸和NADH的反应[1-2]。在快速生长的癌症细胞中，MTHFD2蛋白是嘌呤合成中甲基盐的主要来源[1-2]。 MTHFD2蛋白也是催化5，10-甲基-四氢叶酸和10-甲酰四氢叶酸相互转化的酶[3]。人类MTHFD2基因被定位在2号染色体上[4]，鸡MTHFD2基因被定位在22号染色体[5]。最新研究表明：MTHFD2基因的过表达与肿瘤细胞的增殖和乳腺癌的不良预后有关[1，6]，所以有学者提出把MTHFD2蛋白作为药物开发的新靶标[1]。

鸡作为模式生物在医学研究领域已得到广泛应用。本研究以肉鸡为研究对象，克隆MTHFD2基因，并对其进行生物信息学分析，用定量PCR对其在不同组织的表达谱进行研究，旨在为进一步研究该基因的功能奠定基础，也为预测某些癌症疾病的发生和术后复发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

M-MLV反转录酶(Promega公司)，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]，EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶(NEB公司)，M-MLV反转录酶、Trizol Reagent和RNase Inhibitor(Invitrogen公司)，pMD19-T vector 、SYBR© Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)和LA Taq DNA聚合酶(Takara公司)。

1.2 实验动物及样品采集

试验于2016年2—4月在临沂大学山东省生物学实验教学示范中心完成。随机挑选5只42日龄爱拔益加(Arbor acres，AA)肉鸡，屠宰前空腹12 h，可自由饮水。屠宰后采集肝脏、心脏、胸肌、腿肌、肾脏、脾脏、肺脏和腹脂，用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline，PBS)冲去残留血液，切割成0.5—1 g小块，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 试验方法

1.3.1 组织总RNA的抽提和cDNA第一链的合成

组织总RNA提取采用Trizol法，按照Trizol试剂盒说明书进行。 cDNA第一链的合成利用M-MLV反转录酶合成，操作方法按照说明书进行。

1.3.2 引物设计和RT-PCR扩增

引物设计：根据GenBank上原鸡MTHFD2基因(NM_001031360)序列，利用Primer Premier 6.0软件设计引物MTHFD2-F和MTHFD2-R；根据测序得到的序列设计荧光定量PCR(qPCR)基因表达引物(Exp-F、Exp-R)；以管家基因β-actin(GenBank：NM_205518)为内参，设计引物β-actin-F和β-actin-R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列、退火温度、扩增片段大小

PCR反应体系：在PCR管中加入1.0 μL模板cDNA(50 ng/μL)，2.5 μL 10×LA反应缓冲液，2.0 μL dNTP mix(每种2.5 mmol/L)，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.4 μL MTHFD2-F(20 μmol/L)，0.4 μL MTHFD2-R(20 μmol/L)，0.2 μL(1 U)LA Taq DNA聚合酶，ddH2O补齐至25 μL，吹打混匀后稍离心片刻。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物检测：配制1.2% 琼脂糖，120V电泳检测，用凝胶成像系统观察并拍照。

1.3.3 克隆转化与测序

上述PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段，纯化产物与pMD19-T Vector于16 ℃连接30 min，连接产物转化JM109感受态细胞，然后涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的平板上培养过夜，挑取白斑菌落于3 mL LB培养基中 (含3 μL Amp)，37 ℃摇12—16 h。提取质粒，经EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切鉴定，至少挑取3个阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3.4MTHFD2基因的生物信息学分析

将测序获得的序列用DNAMAN软件寻找开放阅读框(Open read frame，ORF)，推测氨基酸序列，并比较与其他动物MTHFD2的氨基酸序列同源性；在NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上分析保守域等；用MEGA 5.05 软件采用邻近法构建进化树。利用ExPASy(http：//www.expasy.org)分析蛋白质的基本理化性质、蛋白质疏水性、亲水性、蛋白质的跨膜区和三级结构等。

1.4 利用定量PCR(qPCR)分析MTHFD2基因表达水平

采用SYBR Green I 染料法，进行qPCR分析，以鸡管家基因β-actin为内参，分析MTHFD2基因在不同组织中的mRNA表达水平。

qPCR反应体系：10 μL SYBR© Premix Ex TaqTMII，1 μL cDNA(稀释10倍)，0.2 μL Exp-F和0.2 μL Exp-R引物，灭菌超纯水加至20 μL。qPCR反应程序：94 ℃ 2 min； 94 ℃ 10 s，57(55)℃ 10 s，72 ℃ 1 s，40个循环。每个循环后采集荧光生成扩增曲线。试验对所有样本进行3个重复测定，并在每次试验时设阴性对照。根据荧光曲线的Ct值及标准曲线，以鸡β-actin基因为内参，用2-△△ct法计算MTHFD2基因的相对表达量。

1.5 统计分析

采用SAS version 8.2 统计软件对MTHFD2基因的相对表达量进行多重比较统计分析，结果用“平均值±标准误”表示。当P<0.05时，差异达到显著水平；当P<0.01时，差异达到极显著水平。

1—3泳道为MTHFR2基因PCR产物；M：DL2000 DNA maker图1 肉鸡MTHFD2基因PCR产物Fig.1 PCR products of broiler MTHFD2

2 结果与分析

2.1 MTHFD2基因的克隆和序列分析

以42日龄肉鸡肝脏cDNA为模板，用MTHFD2-F和MTHFD2-R引物扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到一条特异性带(图1)，测序后确认长度为1 554 bp，包含鸡MTHFD2基因mRNA开放阅读框(1 014 bp)和部分5’UTR(45 bp)、3’UTR(495 bp)序列，与GenBank上注册的原鸡序列(NM_001031360)有11 bp的差异，其中有10 bp的插入片段，该插入片段位于终止密码子之后，所以不编码氨基酸(图2)。该序列编码337个氨基酸(图2)，氨基酸序列与其他物种比较结果见表2。从表2可见，鸡与日本鹌鹑的氨基酸序列一致性最高，达到97.33%，与山羊的一致性最低。这些结果表明，MTHFD2蛋白在鸟类之间具有高度保守性。将氨基酸序列使用MEGA 5.05 软件采用邻近法构建分子进化树，结果表明鸡与日本鹌鹑聚为一类，进一步说明鸡与日本鹌鹑的亲缘关系较近(图3)。

表2 鸡和其他物种间MTHFD2氨基酸序列一致性比较

图2 肉鸡MTHFD2基因序列与GenBank注册序列(NM_001031360)比对Fig.2 Alignment of MTHFD2 gene sequences between broiler and GenBank (NM_001031360)

注：0.02代表遗传距离，每个节点的数字表示1 000次重复后的靴带百分比图3 MTHFD2蛋白系统发生树Fig.3 Phylogenetic tree of MTHFD2

2.2 MTHFD2理化性质和结构预测

利用ExPASy(http：//www.expasy.org)分析结果表明，鸡MTHFD2蛋白相对分子质量和等电点(PI)分别为36 411.44和9.51。鸡MTHFD2氨基酸组成表明，丙氨酸占的比例最高(11.0%)，包含34个负电荷氨基酸残基(天冬氨酸+谷氨酸)和44个正电荷氨基酸残基(精氨酸+赖氨酸)。不稳定指数为25.86，属于稳定蛋白；脂肪指数为 103.32，亲水性平均系数为-0.066，属于亲水蛋白。用TMHMM程序对鸡MTHFD2蛋白跨膜结构域进行分析，发现该蛋白位于胞外，不具备跨膜结构。利用SOPMA程序预测MTHFD2蛋白质二级结构表明，α-螺旋占31.16%，延伸链(即β-片层结构)占22.26%，β-转角占9.2%，无规卷曲占37.39%，即主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。 三级结构分析表明，以1b0a.1.A为模板，序列一致性为48.94%(图4)。

2.3 MTHFD2基因组织表达谱分析

利用qPCR技术检测MTHFD2基因在肉鸡肝脏、脂肪、肾脏、脾脏、肺脏、心脏、胸肌和腿肌组织中的表达水平。结果发现：MTHFD2基因在所检测的8种组织中均有表达，在腿肌中的表达水平最高，在肝脏中的表达水平最低，且在胸肌和腿肌中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。

图4 鸡MTHFD2蛋白三级结构Fig.4 Chicken MTHFD2 protein three-dimensional model

图5 鸡MTHFD2基因的表达水平Fig.5 Expression levels of chicken MTHFD2

3 讨论

在本研究中，从AA肉鸡肝脏中克隆得到鸡MTHFD2基因cDNA的部分序列(1 554bp)，所扩增的序列与GenBank上(NM_001031360)注册的原鸡核苷酸序列一致性为99.29%，氨基酸一致性为100%。值得注意的是，与GenBank上注册的序列相比在终止密码子之后发现有10bp的插入片段，这可能是MTHFD2基因的不同转录变异体，这个插入片段对MTHFD2基因的结构和功能以及鸡的生长发育是否有影响，需要进一步研究。另外，试验对MTHFD2基因在不同组织中的表达水平进行了分析，为进一步研究MTHFD2基因的功能奠定了基础，也为叶酸代谢相关酶在疾病治疗中提供参考。

目前，对MTHFD2基因功能的研究主要集中在人类癌症方面。研究发现MTHFD2作为转录因子Nrf2的转录靶标，负责嘌呤的合成，可导致癌细胞的增殖[7]。MTHFD2蛋白在许多癌症中表达水平均有显著提高，并且与乳腺癌患者的低生存率相关[8]。Liu等[6]对乳腺癌患者组织切片进行蛋白印迹和免疫组化检测，也发现了类似的结果，认为这种蛋白质可能是未来乳腺癌治疗的独立预后因素和潜在的治疗靶点。刘新城等[9]报道肝癌组织中MTHFD2基因的表达水平显著高于正常组织，且这种高表达与肝细胞癌转移、复发有密切关系，由此预测MTHFD2基因可以作为预测肝癌患者预后的生物标志物。Hall等[10]发现MTHFD2基因编码的酶参与甲硫氨酸循环相关的叶酸循环，甲硫氨酸循环又控制S-腺苷甲硫氨酸的量，人类胰岛经过棕榈酯处理后改变了S-腺苷甲硫氨酸水平，从而导致全基因组甲基化和CpG岛甲基化水平改变，故MTHFD2基因表达可能影响甲基供体的量。本研究的组织表达谱显示，MTHFD2基因在腿肌中表达水平最高，而在肝脏中的表达水平最低，表达水平的差异可能与动物品种有关。

尽管本试验对肉鸡MTHFD2基因部分序列进行了克隆和组织表达谱研究，但其功能还不是太明确，与叶酸代谢途径中的其他代谢酶相比，例如MTHFR，目前对于MTHFD2基因的研究主要集中在人类疾病方面，对畜禽的研究才刚刚开始，所以，MTHFD2基因在不同物种中的确切功能及其作用机制和差异也不清楚，需要进一步探讨。