香根草对铜绿微囊藻的生长抑制及其成分分析

潘 琦，刘娅琴，邹国燕，周文宗，付子轼，刘长娥，宋祥甫

(上海市农业科学院，上海201403)

随着社会经济的发展，大量废水和生活污水排入湖泊和江河，引起地表水体严重污染。富营养化水域日益增多，导致藻类特别是蓝藻迅猛生长，由此引发的水华或赤潮，在破坏原有水体生态系统平衡[1]的同时，也严重威胁到了人类健康。改善富营养化水体水质，有效控制有害藻类生长已成为环境科学领域的研究热点。现有抑藻方法一般分为化学法、物理法和生物法[2]。但这些方法存在可能形成二次污染、见效慢等缺点，使其推广受到限制[3-4]。因此，迫切需要寻求更加高效安全的抑藻技术。利用植物的化感作用抑制藻类生长，为控制水华提供了新的研究思路。

植物化感作用抑制藻类生长以其效率高、生态安全性好等特点而备受关注[5-7]。化感作用是指一种植物通过向环境释放化学物质促进或抑制其他植物生长的现象。目前，已发现多种水生植物具有化感作用，这些植物产生的次生代谢产物，通过多种方式抑制藻细胞的生长。如粉绿狐尾藻可破坏集胞藻的叶绿素a和藻胆蛋白的特征吸收峰，降低藻细胞对光的吸收能力；芦苇的化感物质EMA能造成藻类细胞膜的彻底破坏，使K+、Ca2+、Mg2+外泄，从而使藻细胞死亡[8]。在已发现的植物化感物质中，脂肪酸和酚类化合物较为常见。张庭廷等[9]从普生轮藻中分离得到的3种脂肪酸(亚油酸、软脂酸和豆蔻酸)，均有不同程度的抑藻作用。Gross等[10]发现，狐尾藻除脂肪酸外，其多酚类物质也具有抑藻活性；此外，萜类和酯类等也被证实具有较好的抑藻效果[11-12]。

香根草为禾本科香根草属多年生植物，其根系能富集重金属、吸收水体氮磷[12-14]，具有生长速度快、净化水质能力强、适应性强等特点，是一种净化富营养化水体的理想植物。本研究以香根草作为供试植物，探讨其对蓝藻水华的主要组成者——铜绿微囊藻的抑制效果，并对其根系分泌物中的化学物质进行分析，以期为利用陆生植物控制有害藻类的生长提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为香根草(VetiveriazizanioidsLinn.)，供试藻类为蓝藻门的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)，藻种来自上海师范大学。采用Modified C(CB)[15]营养液作为藻类试验的培养液，培养温度为25℃，光暗比为14 h∶10h，由冷白荧光灯提供光照，光照强度为3 000 lx。

1.2 试验方法

香根草在塑料大棚内陆地育苗后，选择同期同龄的香根草2株(二者质量平均值为820 g)。将其根系用蒸馏水洗净，分别置于盛有10 L蒸馏水的塑料桶内培养5 d，之后从塑料桶中分别收集1 L种植液，并进行充分混合。香根草生长情况如表1所示。

表1 试验所用香根草生长情况

1.3 样品采集及分析方法

1.3.1 样品采集

种植水样品：香根草种植水过滤后，用HCl调至pH 1.5，取150 mL用Oasis HLB固相萃取柱进行固相萃取。 萃取前先用4 mL甲醇活化萃取柱，再用4 mL蒸馏水(用HCl调pH至1.5)清洗，香根草种植水以3 mL/min的速度过柱，用pH 1.5的蒸馏水洗柱。 待水完全抽干后，用20 mL甲醇洗脱柱子上的提取物。 洗脱液用无水硫酸钠脱水，R-205旋转蒸发仪浓缩至5 mL，作为香根草种植水样品。

种植水与藻类培养：香根草种植水经Waterman玻璃纤维滤膜(GF/F 47 mm，孔径0.52 μm)过滤后，取100 mL过滤液并添加CB营养液使之与藻类培养液浓度相同。在无菌条件下使用Millex-GP针头过滤器抽滤灭菌。取灭菌后的种植水10 mL，接种100 μL的铜绿微囊藻液(试验初期铜绿微囊藻密度为1×104个/mL)，加塞后摇匀。取10 mL经灭菌的CB培养液并接种100 μL的铜绿微囊藻液作为对照组。接种微囊藻的种植水和对照处理均各重复3次。上述操作均在无菌条件下完成。将锥形瓶置于25 ℃、3 000 lx、80 r/min的光照振荡培养箱中培养。

1.3.2 测定方法

每3 d使用血球计数板计算藻细胞密度，记录1次接种微囊藻的种植水和对照处理下的藻类数量；铜绿微囊藻的叶绿素a采用分光光度法进行测定。

香根草种植水对藻类的抑制率(RI)：RI=(1-N/N0)×100%。其中，N为香根草种植水组藻密度，105个/mL；N0为对照组藻密度，105个/mL。

取香根草种植水样品2 mL，于45 ℃下氮气吹干后，加入100 μL硅烷化试剂(BSTFA)和200 μL正己烷，封管后于120 ℃下反应0.5 h，取1.0 μL该反应液经GC-MS(安捷伦5975C，美国)对其化合物组成进行分析。GC-MS测定条件：检测仪器为Finnigan Voyager气相色谱-质谱联用仪，质量扫描范围35—290原子质量单位(amu)，色谱柱为VF-5 ms石英毛细管柱(柱长30 m×内径0.25 mm，膜厚0.25 μm)；接口温度28 ℃，柱温为80 ℃，保持2 min，以20 ℃/min的速率升至300 ℃，保持10 min，汽化温度为250 ℃；载气为He，流量为1.0 mL/min；分流比为20∶1；进样量为1.0 μL[16]。

质谱检测器：EI源，电子能量70 eV，源温200 ℃，得到分离后的总离子流图和各组分质谱图。使用 NIST 谱库进行图谱检索，并使用面积归一化法计算各种物质的相对含量。

1.4 数据处理

使用SPSS 9.0软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

将添加CB营养液的香根草种植水以及对照组分别与藻类培养21 d后发现，2种培养液中铜绿微囊藻均有不同程度的生长。与对照组相比，香根草种植水与藻类培养中的铜绿微囊藻生长缓慢。香根草种植水与铜绿微囊藻共培养6 d后，香根草种植水开始对铜绿微囊藻的生长产生抑制作用，且抑制作用随时间的推移而增加；共培养15d后，种植水对藻类的抑制作用开始下降，其对铜绿微囊藻的抑制率最高可达到76%(图1)。

图1 香根草种植水对铜绿微囊藻的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of root exudates solution of V.zizanioids on growth of M.aeruginosa

使用种植水进行试验，可以避免种植的香根草与藻类竞争光照、营养和空间等因素对其生长产生的影响，从而体现香根草对藻类作用的试验目的。种植水添加CB营养液后，用NaOH调节种植水的pH至8，以避免香根草根系分泌物的有机酸类物质可能会降低水的pH，进而影响藻类的生长。由此证实香根草对藻类的抑制作用是其所释放的化感物质对藻类细胞的生理影响。

叶绿素a是反映藻类是否正常生长和光合作用的重要指标之一。在本试验中铜绿微囊藻在香根草种植水中培养21d后，种植水中藻类叶绿素a含量为 447.62mg/L，对照组铜绿微囊藻叶绿素a含量则高达3 592mg/L，对照组铜绿微囊藻叶绿素含量是香根草种植水的8倍，差异极显著(P<0.01)。

蒸馏水培养5d后收集到的香根草种植水和根系提取物的样品，经GC-MS分析(图2)，香根草种植水中的成分主要为脂肪酸。通过与NIST谱库中的标准物质进行匹配，筛选得到一些匹配度较高的化合物。表2显示，从香根草种植水中共鉴定出 24 种化合组分，其中2-羟基丙酸相对含量最高，为 50.71%；其次是棕榈酸，相对含量为 23.2%。

图2 香根草种植水和根系提取物 GC-MS图谱Fig.2 Total ion chromatogram of the secretions and the root extraction of C.indica by GC-MS

保留时间∕min化学物质相对含量∕%相似度∕%4.142-羟基丙酸50.7187.814.34乙醇酸3.3688.41 4.55己酸1.2587.445.06呋喃二羧酸0.3376.075.11丙二酸0.4871.015.27β-羟基丁酸0.5380.986.761-羟基,2-烯戊酸0.2388.496.86琥珀酸0.5983.216.972,3-二羟基丙酸0.9095.207.21延胡索酸0.1483.097.912-羟基丁二酸1.4291.978.41苹果酸0.8184.538.832,3,4-三羟基丁酸0.2178.298.953-甲氧基,4-羟基苯甲醛0.0983.239.80月桂酸0.2985.6410.11邻苯二甲酸0.2493.7310.99十四烷酸0.1990.2311.74十五烷酸0.1585.5412.41棕榈油酸1.1492.2612.57棕榈酸23.2096.4513.19十七烷酸0.9185.2713.63油酸3.3287.2013.78硬脂酸5.2296.8215.93扁油酸1.1389.37

3 讨论与结论

植物释放的化感物质通过抑制藻类细胞酶活性、破坏藻类的光合作用、破坏细胞膜等方式影响藻类的正常生长[19-20]。研究显示[21-22]，通常情况下化感物质浓度较高时会显著抑制植物的生长发育，随着其浓度的降低，该抑制作用会逐渐减弱、消失甚至转变为促进作用。本试验中的香根草种植水对铜绿微囊藻的生长具有一定抑制作用，可见香根草在蒸馏水中培养5d后其根系分泌的化感物质就达到了较高浓度，因此抑制了铜绿微囊藻的正常生长。叶绿素a是反映藻类是否正常生长和光合作用的重要指标之一。研究显示[23-25]，化感物质通过降低藻类叶绿素含量、抑制光合系统电子传递连活性等，减少藻类同化产物的方式而抑制藻类生长。与香根草种植水共培养21d后的铜绿微囊藻叶绿素含量降低，这可能是由于香根草种植水中化学物质阻碍了铜绿微囊藻叶绿素a的合成或加速了叶绿素a的降解。经NIST 谱库比对，香根草种植水中有己酸、棕榈酸、硬脂酸等物质。Nakai等[26]从穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)中获得了包括棕榈酸、硬脂酸和油酸等多种脂肪酸，并证明这些脂肪酸对铜绿微囊藻的生长有抑制作用。本研究发现，种植香根草5 d后，其水中就出现了可抑制藻类生长的化感物质，并且也以脂肪酸居多。研究结果表明[27-28]：己酸、棕榈酸、硬脂酸等脂肪酸对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和斜生栅藻有抑制作用。胡陈艳等[29]研究马来眼子菜体内脂肪酸类物质对羊角月牙早的抑制作用时，也发现多种脂肪酸联合作用具有协同抑藻效果。由此推测，可能是香根草根系释放到水体中的脂肪酸共同作用抑制了铜绿微囊藻的生长。文媛等[30]将香根草根系浸提为净油进行成分分析，发现香根草净油成分主要为醇类，酮类、酸和萜烯类化合物。本研究中香根草种植水中基本成分多为有机酸类，这可能是由于试验中根系分泌物收集偏重有机酸类物质，也可能是由于香根草根系化合物在富营养化水体环境下转换形成新的化感物质而抑制藻类生长，具体理化机制还有待进一步深入研究。

气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)被广泛应用与药物检测、环境 分析、司法鉴定和未知样品的测定，具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点[31]。本试验通过GC-MS技术初步测定了香根草种植水中可能有的化感物质，但具体是哪些化合物对铜绿微囊藻产生抑制作用，这些化学物质对铜绿微囊藻的抑制是否存在协同作用还有待于进一步研究。

本试验发现，香根草除了可以有效净化水质外，对于水华灾害中的优势藻种铜绿微囊藻具有极强的抑制作用。香根草对湖泊富营养化水体中的总氮，总磷具有明显的去除效果[32]，能显著改善富营养化水体的水质[33-35]。同时，香根草是集原料、饲料、燃料三料于一体的经济植物，是一种性能优良的草类资源[36]。因此，通过浮床种植香根草在改善生态环境的同时，又可产生商业价值，具有巨大的发展潜力。

浮床植物香根草的存在可以持续抑制铜绿微囊藻的正常生长。蒸馏水培养5 d获得的香根草种植水与铜绿微囊藻共培养21 d后，对铜绿微囊藻生长的抑制率可达76%，对照培养液中铜绿微囊藻叶绿素a含量是香根草种植水中的8倍；蒸馏水培养5d后采集香根草种植水，经GC-MS分析获得己酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸等24种化合物，大多为有机酸类。