无抗日粮背景下对四种常见益生菌制剂的评估

◆作者：魏可健 舒丹平 周琪琪 曾得寿 谭现义 刘绪同 刘炀

◆单位：深圳市金新农科技股份有限公司，深圳，518106

几十年来，抗生素已广泛应用于动物生产，据报道，中国抗生素的使用量和排放量远远高于欧美发达国家，其中动物用抗生素占总量的52%。由于大量使用抗生素引发了药物残留、抗生素耐药性、环境污染等问题，欧盟委员会于2006年已禁止在饲料中添加抗生素作为生长促进剂。美国也在消费者压力的推动下逐渐淘汰促生长用抗生素的使用（Castannon，2007）。随着禁抗的步伐不断加速，研究探索新的抗生素替代品已成为迫在眉睫的需求。

益生菌制剂是一种含有单一或混合活菌的添加剂，当摄入有效剂量的益生菌制剂会对机体产生有益的作用。益生菌广泛用于食品行业和动物生产中，其主要成分活菌能够在肠道内定植，抑制有害菌的生长繁殖，促进肠道的微生态平衡。其代谢产物还能够调节肠道免疫，维持肠道的正常功能，使机体的免疫能力增强，提高肠道对食物的消化率。已发表的研究结果表明益生菌对动物生长性能的促进作用存在较大的差异，可能是由于益生菌的使用剂量、益生菌类型、使用时间、饲料稳定性及理化性质和养殖管理等因素的影响。在商业生产中被广泛应用的益生菌制剂有:乳酸杆菌属、双歧杆菌属、乳球菌属、酵母菌属和芽孢杆菌属。其中芽孢杆菌属、肠球菌属和酵母菌属是动物养殖中使用最普遍的益生菌属。（Ferreira等，2011）由于益生菌制剂含有活菌的属性，进入动物体消化道的过程中会被各种消化液作用而部分失活。且益生菌不能耐受过高的温度，这也使得其在饲料生产中受到制约。因此，了解常见的益生菌制剂的生物活性对饲料生产领域具有重要的参考价值。试验通过研究四种常见益生菌的耐高温能力、耐胃酸和胆盐能力和抑菌性，以求为更好地发挥益生菌制剂在饲料工业中的作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 益生菌制剂

益生菌制剂包括枯草芽孢杆菌（≥1×1010CFU/mg）、地衣芽孢杆菌（≥1×1010CFU/mg）、丁酸梭菌（≥1.5×1010CFU/mg）和屎肠球菌（≥3×109CFU/mg）。

1.1.2 指示菌

大肠杆菌ATCC25922；沙门氏菌ATCC14028；产气荚膜梭菌ATCC13124。

1.1.3 培养基

LB固态培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物 5g，氯化钠 10g，琼脂粉15g，加入1000mL H2O完全溶解后，调pH值至7.3±0.1，121℃灭菌20min。脱脂乳培养基：脱脂乳粉10g，蒸馏水100ml，经过115℃高压蒸汽灭菌15min。

营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉 3.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，调节pH 7.4±0.2，经过121℃高压蒸汽灭菌15min。

RCM培养基：牛肉浸出粉1.0g，胨 1.0g，酵母浸出粉 0.3g，可溶性淀粉0.1 g，葡萄糖0.5 g，盐酸半胱氨酸 0.05g，NaCl 0.5g，乙酸钠0.3g，琼脂0.05g，蒸馏水100mL，调节 pH 6.8±0.2，经过121℃高压蒸汽灭菌15min。

平板计数琼脂培养基：胰蛋白胨 5.0g，酵母浸粉 2.5g，葡萄糖 1.0g，琼脂 15.0g。

LB固体培养基：氯化钠1g、蛋白胨1g、酵母浸提物0.5g、琼脂粉1.5g、水100ml。调pH值为7.0±0.2。121℃，高压 灭 菌15min，灭菌后可放置在80℃的水浴锅或者烘箱中保温。

蒸馏水1000mL，调节pH 7.0士0.2，经过121℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.1.4 试验器材

移液枪（枪头）、牛津杯、培养皿、离心管、酒精灯、止血钳、超净工作台、电热恒温培养箱、离心机、自动pH测定仪、高压灭菌锅、天平、灭菌器、培养皿、试管、烧杯、量筒、酒精灯、牛津杯。

1.2 试验方法

1.2.1 高温耐受性试验

①菌液的制备：分别称取1g样品加入10 mL无菌水，震荡混匀，备用。

②试验方法：用平板计数法分别对四种益生菌制剂的起始菌液浓度进行计数。且按1%剂量将菌液加入含有80%甘油和20%无菌水的混合液，将处理液置于85℃的水浴锅，水浴5 min。水浴结束，使用平板计数法对水浴处理后的菌液浓度进行计数。

1.2.2 胃酸和胆盐耐受性试验

①配置模拟胃液：用10M HCl将无菌生理盐水调节至pH=2.5，每100mL液体加入1g胃蛋白酶，混匀，用0.20μm的无菌滤头过滤待用。

②配置模拟小肠液：用10M HCl将无菌生理盐水调节至pH=6.8，每100 mL液体加入1 g胰蛋白酶、0.3 g胆盐，混匀，用0.20 μm的无菌滤头过滤待用。

③试验方法：按1%剂量将1.2.1中制备好的菌液加入10 mL模拟胃液中，于37℃水浴1h。在6000r/min条件下离心6min，去上清液，加入10mL无菌生理盐水重悬，此步骤重复三次。将重悬后的菌液在6000rpm条件下离心6min，去上清液。加入10 mL制备好的模拟小肠液，于37℃水浴2h。水浴结束，使用平板计数法对处理后的菌液浓度进行计数。

1.2.3 牛津杯抑菌试验

①菌种的活化：大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌为指示菌。分别对四种益生菌制剂和三种指示菌进行划线培养，挑取单菌落加入对应的液体培养基进行扩增，于37℃培养48 h（丁酸梭菌和产气荚膜梭菌在厌氧罐中培养），备用。

②固体培养基的配置：在已灭菌的培养皿中倒入15 mL LB固体培养基进行封底。待第一层培养基凝固。待LB固体培养基放置到不烫手后，每100mL LB固体培养基中，加入100uL菌液，混匀。倒入之前配置好的已经凝固的培养基中，每个培养基倒入5mL。

③试验方法：将牛津杯放置于培养基5～10min后，待培养基凝固，用止血钳取出牛津杯，在培养皿底部写好记号，对应沿圆环外壁均匀加入10uL样品溶液，放入37℃恒温培养箱中培养24h（丁酸梭菌和产气荚膜梭菌在厌氧罐中培养）。

2 试验结果

2.1 高温的耐受性试验

由表1可知，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌对高温均有较高的耐受性，在85℃水浴5 min后细菌存活率均高于80%。而屎肠球菌对高温的耐受能力较弱，经过高温水浴后存活率仅不到5%。

表1 益生菌制剂对高温的耐受性

表2 益生菌对胃酸和胆盐的耐受性

2.2 胃酸和胆盐的耐受性试验

由表2可知，经过处理后的枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌的存活率均大于90%，试验表明枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌对胃酸和胆盐的耐受力较强。地衣芽孢杆菌对胃酸和胆盐的耐受能力相较枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌稍弱，但强于屎肠球菌，细菌存活率达到72.94%。屎肠球菌经过胃酸和胆盐处理后细菌的细菌存活率只有30.53%。

2.3 牛津杯抑菌试验

由表3可知，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和屎肠球菌对大肠杆菌均无抑制作用；地衣芽孢杆菌可以抑制产气荚膜梭菌的生长，而枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌对沙门氏菌和产气荚膜梭菌均没有抑菌作用。屎肠球菌可以抑制沙门氏菌的生长，但对大肠杆菌和产气荚膜梭菌无抑菌效果。

3 讨论

3.1 益生菌制剂对高温的耐受性情况

益生菌制剂是一类生物活性添加剂，在畜产品安全和环境保护中发挥重要作用。但由于益生菌制剂的主要功能性物质是活菌，在运输、生产和贮存的过程中均存在失活的风险，所以产品质量不稳定是益生菌制剂存在的主要问题之一（舒娜等，2003）。本试验发现地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌对高温均有较好的耐受性，细菌存活率都达到80%以上。丁酸梭菌制剂中活菌是以芽孢形式存在的，在高温环境具有很强的稳定性；经80℃热处理30 min全部存活，经100℃热处理5 min后30%存活（易中华，2012）。芽孢特殊的生物构造及其对热应激较完善的调节机制使芽孢菌耐热性较强，与本试验的结果基本一致。宋献艺等（2018）的试验发现屎肠球菌经过80℃热处理30 min后，存活率仅为17%。经过80℃热处理60min后无活菌存活。宋（2018）的研究表明屎肠球菌对高温的耐受能力较弱，这一结果与本试验结果基本一致。试验结果提示益生菌制剂在饲料加工过程中应优先选择对高温耐受性较好的芽孢菌。而对于不耐高温的益生菌，应通过改良加工技术优化其对环境的适应能力。

表3益生菌制剂的抑菌作用效果

3.2 益生菌制剂对胃酸和胆盐的耐受性情况

益生菌主要在动物的肠道中发挥作用，通过调节肠道微生态的平衡，增强动物免疫能力，维持动物的健康状态。胃液有强酸性且含有胃蛋白酶，而小肠中胆 盐 浓 度 达 到 0.3%（w/v）。（Chou L等，1999）益生菌在消化道中需要经历2 h的低pH胃酸环境和小肠中高浓度的胆盐环境（李善仁等，2010）。低pH条件或疏水条件会解离益生菌的膜蛋白，进而导致细胞死亡（宋献艺等，2018）。本试验的结果表明地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对胃酸和胆盐均表现较好的耐受性，其中枯草芽孢杆菌的对胃酸和胆盐的耐受力强于其他三种益生菌制剂，细菌存活率最高达到93.74%。李善仁等（2010）的试验中3株枯草芽孢杆菌在0.3%胆盐处理2 h细菌存活数略有下降，无显著差异，与本试验结果基本一致。屎肠球菌经过胃酸和胆盐处理后，活菌存活率仅为31.53%，相较于试验中其他三种益生菌制剂耐受能力较弱。丁酸梭菌能够耐受胃液、胆盐和消化液（易中华，2012）。本试验结果发现丁酸梭菌经过1 h模拟胃液处理和2 h模拟小肠液处理后细菌存活率仍达到90.03%。试验一定程度可以表明以芽孢形式存在的益生菌制剂经过胃肠道更能保证活菌数量，从而能够更好地发挥有益作用。

3.3 益生菌制剂的抑菌效果

抑菌性是益生菌的一个重要作用。益生菌能够产生具有抑菌效果的酶类、酸类等生物活性物质或通过竞争抑制病原菌的生长（郭志杰等，2010；吴惠芬等，2005）。本试验以沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌三种病原微生物作为指示菌验证益生菌制剂的抑菌效果。结果表明丁酸梭菌对三种指示菌均无明显的抑菌作用。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌对大肠杆菌和沙门氏菌均无明显的抑菌作用，但地衣芽孢杆菌对产气荚膜梭菌表现出了抑菌效果。但李善仁等（2010）的试验发现三株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌均表现出来抑菌作用；张雪平等（2001）的研究表明丁酸梭菌能够抑制肠内致病性大肠杆菌、伤寒沙门氏菌等有害菌的生长繁殖。益生菌的抑菌效果存在不稳定性，同时菌株或培养环境的差异、益生菌制剂的加工工艺均会影响试验结果，具体机制仍需要进一步进行研究。本试验中屎肠球菌对沙门氏菌具有抑菌作用。Simova等（2009）的研究发现从乳制品中分离的屎肠球菌在发酵中产生细菌素，可以抑制病原微生物的生长。夏玉等（2014）的研究表明屎肠球菌发酵乳对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有良好的抑制作用，与本试验的结果基本一致。

4 结论

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌对高温、胃酸和胆盐均有较好的耐受性，而屎肠球菌的耐受能力较弱。

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和屎肠球菌对大肠杆菌均无抑制作用。屎肠球菌可以抑制沙门氏菌的生长，地衣芽孢杆菌可以抑制产气荚膜梭菌的生长。

参考文献：（略）