布鲁氏杆菌病检测方法的对比试验

郭田顺 袁枭龙 丁 勇*

1.河北省张家口市动物疫病预防控制中心，河北张家口075000；2.河北省怀安县农业农村局，河北怀安076150

布鲁氏杆菌病是一种人畜共患病，近年来，在牛、羊中流行呈增长趋势，布病是急性传染病，也是职业病，布鲁氏杆菌为细小的球杆菌，革兰氏染色阴性。布鲁氏杆菌的实验室诊断方式最常用的有：

1）平板凝集虎红试验（虎红平板凝集试验）：操作简单快速、价格便宜。

2）试管沉淀，试管凝集试验（确诊方法）：血清凝集滴度（价）在1∶50以上为阳性，l∶25 为可疑，可疑多在3～4 周后采血重检。如仍为可疑，则列为阳性。操作相对复杂、方法繁琐费事、反应时间长。

3）布鲁氏杆菌的试纸条（胶体金试纸条）：快速反应诊断，这是近几年出现的快速诊断方法。

4）ELISA：简单、快速、敏感性高、特异性高、结果易于判定、易于标准化、可实现高通量检测。但需要时间长，一般不采用本方法。

为了准确诊断本病，笔者做了许多对比试验（6 538 头奶牛和1 368 只羊）。

1 材料与方法

1.1 试剂

虎红凝集布鲁氏杆菌抗原、布鲁氏杆菌阳性血清、试管沉淀凝集布鲁氏杆菌抗原（与阳性抗原）、布鲁氏杆菌快速反应试纸条，布鲁氏杆菌ELISA试剂反应盒。

1.2 方法

平板凝集试验、试管凝集试验、快速反应试纸条、布鲁氏杆菌ELISA 试剂反应盒（结果对比与分析）。

1）平板凝集试验（包括玻璃片或特制塑料平板或纸质一侧加塑料膜的反应板）：取奶牛血清滴1 滴于反应板上，再加入1 滴虎红凝集抗原用牙签或火柴搅拌均匀，3～5 min 开始观察，观察结果共计6 538例，出现假阴性6例，阳性12例，可疑（即**或*凝集度）32 份。

2）布鲁氏杆菌抗体快速检测卡具有方便、快速、灵敏度高等特点，缺点是价格贵，增加养殖成本，适用于现场大批量样品检测，包括快速检测卡、滴管、稀释液，取出检测卡，开启后平放于操作台上，将待检样品滴入点样孔，再加2 滴样品稀释液于样品孔中，加样5 min 后，观察显色区，阴性为C 线显色，T线不显色，阳性为C 线显色，T 线肉眼观察，无论颜色深浅均判阳性，无效为C 线不显色，T 线无论显色或不显色，都判无效。注意检测卡开启后，1 h 内必须使用，不能重复使用，滴加稀释液后30 s 内，在显色区无液体移动再补滴1 滴稀释液。检查结果较精准，结果：38 份阳性，12 份可疑，反复做2 次结果相同。

3）试管凝集试验法或96 孔反应板凝集试验法（可参照鸡ND96 孔凝集反应）：将分离出的被检血清用PBS液作连续倍比稀释，加入1 滴试管凝集抗原，放置在一定室温和一定时间观察各种稀释度的凝集效价。

具体操作为：①取小试管9 只排列于试管架上，自左至右顺序为1～9 号；②于第1 管内加PBS液0.9 mL，从2～9 只试管各加入PBS 液0.5 mL；③用移液管吸取被检血清0.1 mL，加在第1 只试管内混和均匀后，吸出0.5 mL，加入第3 只试管，如此连续稀释至第7 只试管，混和均匀后吸出0.5 mL 弃去，第8 只试管加0.5 mL 1∶50稀释的诊断血清，为阳性对照，第9 只试管加入PBS 液0.5 mL 为阴性对照。血清的稀释顺序为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 及1∶640；④于上述试管内，均加入试管凝集布鲁氏杆菌病诊断液，摇晃震动试管架数分钟，使反应液混和均匀；⑤将试管架放置37℃经18～24 h 观察结果；⑥按反应强弱记录结果，并用“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、“++++”作凝集程度的标记。“++++”全部凝集，上层液体透明。称“100%”凝DN，“+++”明显凝集，上层液体基本透明，或称75%凝集；“++”上层液体较浑浊，但试管底可见凝集沉淀，或称25%凝集；“+”可凝反应，“-”不凝集，阴性反应。出现阳性38 份，可疑12 份。

4）ELISA。酶联反应是在免疫学的基础上，利用抗原、抗体的特异性，其反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的新技术。抗原与抗体的反应是在聚苯乙烯96 孔微量反应板内进行，每加入一种试剂作用后，经过多次洗涤除去多余的游离反应物，其特异性与稳定性得以保证。在试验中主要有：间接法检测抗体、夹心法检测抗原的双抗体以及竞争法检测小分子抗原或半抗原的抗体等，比较常用的是夹心法与间接法。测定操作非常简单，有标本的收集、保存、准备试剂、加样、温育、洗板、显色、比色、结果报告和结果判断及解释等，每个步骤都要操作精细，如有不当都会影响测定结果，加样、温育和洗板3个步骤最重要。最为常用检测样品是血清（浆）、唾液（用于特定的检测目的）、脑脊液、尿液、粪等。

具体操作步骤如下：

①包被（注意设置阴性对照、阳性对照和空白对照）。将使用抗原用包被稀释液稀释到使用浓度按照说明书用量来操作，置37℃培养箱培养4 h，或4℃放置24 h；将孔中液体甩掉弃去（板上加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中，其目的是防止水分快速蒸发）。

②酶标反应孔的封闭。用配制消毒好的5%健康小牛血清滴入孔内置37℃恒温箱封闭40 min，封闭液加满各反应孔，各孔中不要有气泡出现，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3 遍，每遍洗涤3 min。洗涤方法：吸干孔内反应液，将洗涤液注满板孔，放置2 min 略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3 次。

③加入待检测样品。检测时一般采用1∶200的稀释度，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每个样品至少加双孔，每孔100 μL，置于37℃恒温箱40～60 min。用洗涤液满孔洗涤3 遍，每遍3 min。

④加入酶标抗体。酶标抗体：根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行，37℃，30～60 min（＜30 min 往往结果不稳定），每孔加100 μL，洗涤同前。

⑤加入底物液（现用现配）。首选TMB—过氧化氢尿素溶液，OPD—过氧化氢底物液系统次之。底物加入量：每孔100 μL，置37℃避光放置3～5 min，加入终止液显色。

⑥终止反应。每孔加入终止液50μL，终止反应，于20 min 内测定试验结果。

⑦结果判断。OPD 显色后采用492 nm 波长，TMB反应产物检测需要450nm波长。检测时一定要首先进行空白孔系统调零，用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值（P/N）表示，当P/N＞2 时作为抗体的效价（数值的大小依具体检测要求而定）。阳性46 份，可疑4 份。

3 结果分析

4种方法中，平板凝集是定性判断，准确度略低；试管凝集是定量判断，准确度较高，与近几年纸片快速诊断相近，但准确度略低；纸片快速诊断是实验室中诊断布鲁氏杆菌病较准确的方法之一，为净化布鲁氏杆菌病提供了有力手段。

4 结语

近年来，随着奶牛业发展，对布鲁氏杆菌的净化力度不够，造成奶牛小区布病增多，其主要原因：一方面是经济利益所致，只为数量，不要求质量；另一方面相关部门把关不够。解决措施：①加强学习，让人们了解本病的危害性，提高认识；②加大投入，对检出病牛强制性扑杀；③提高净化力度，做到应检尽检；④相关部门紧密配合，上下联动打赢布病净化攻坚战。