猪A型塞内卡病毒研究进展

花群俊，林彦星，杨仕标

(1.武定县动物疫病预防控制中心，云南 武定 651600；2.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；3.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224)

猪塞内卡病毒病是近年来发现的由塞内卡病毒(Seneca Valley Virus，SVV)感染引起猪出现水泡性病变的一种传染病。其特征是引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂从而导致跛足甚至死亡，临床症状与口蹄疫、猪水泡病等我国规定的一类动物传染病相似。塞内卡病毒从发现至今不足30年，全球范围内对该病病原学、流行病学等方面的认识仍相对空白，普遍缺乏对病毒抵抗能力、传播途径、潜伏期、扩散期、致病性、针对性预防方法和免疫方法的了解。另外，研究人员发现，美国目前分离到的A型塞内卡病毒与20世纪80年代出现的病毒属于同一病毒株，与巴西出现的病毒基因有98.6 %的相似性，但与加拿大前几年发现的病毒基因相似性较低(86.7%～90.5%)，表明该病毒是易突变的RNA病毒，导致病毒本身的不确定性进一步增加。

1 病原学特性

1.1 病原发现

SVV最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清[1]。2002 年，由美国基因治疗公司在马里兰州使用 PER.C6 细胞(转化的胎儿成视网膜细胞)培养腺病毒-5(Ad5)病毒载体时分离到塞内卡病毒-001(SVV-001)[2]。多年来，SVV主要作为溶瘤细胞进行研究，用于治疗某些神经内分泌肿瘤，一直被认为是一种非致病性病毒。2007年，一批自加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡、蹄部冠状带溃烂等类似水疱病的症状，经检测排除口蹄疫、猪水泡病、水泡性口炎，最终通过PCR检测确定为SVV阳性。2014年10月后，该病毒先后大规模影响巴西、美国的猪场，才逐渐被全球各国所关注。

调查发现，20世纪80年代末该病毒已存在于家畜中，除猪外，牛和小鼠等动物也有检测到SVV抗体的报道，在当时被认为是猪特发性水泡病(Porcine Idiopathic vesicular disease，PIVD，指不由口蹄疫、水疱病、水疱性口炎和水疱性疹所引起的出现水疱病变临床症状的疾病的统称)的病原[3]。2015 年7 月，巴西报道了一起与SVV感染有关的新生仔猪死亡综合征(neonatal losses syndrome)。主要影响 0～7 日龄的仔猪，0～3 日龄的仔猪死亡率高(40%～80%)，4～7 日龄的仔猪表现出中等死亡率(0～30%)。受影响的母猪场出现新生仔猪死亡率突发性增长，不过在 4～10d内恢复到正常的死亡率水平。对几个猪群受影响的仔猪进行病理学研究，发现仔猪的多个组织，包括大脑、血液和淋巴组织都有大量的塞内卡病毒，这表明存在病毒的普遍感染[4]。虽从死亡病例中分离到的不同病毒毒株之间存在基因相似性，但并未发现可以用来解释仔猪死亡原因的特征性病变。研究人员将其称为流行性暂时性新生仔猪死亡(epidemic transient neonatal losse，ETNL)。

1.2 病毒结构和分类

塞内卡病毒(Seneca Valley Virus，SVV)在分类学中属于小RNA 病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)A型塞内卡病毒(Senecavirus A)的唯一成员[5]。通过对小RNA 病毒科12个代表性病毒属病毒进行全基因组序列比对发现，SVV与心肌炎病毒属遗传关系最近，为直径约27nm的二十面体无囊膜单股正链不分节段的RNA病毒，其基因组含有7280个核苷酸，其中包括了5′端666个核苷酸的非编码区，一个开放阅读框含有6543个核苷酸，编码2181个氨基酸的多聚蛋白，可分割成12个成熟多肽，构成5′-L-1A-1B-1C-1D-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′模式，3′非编码区有 71 个核苷酸，带有Ploy(A)。该病毒目前仅有一个种类，被命名为A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)。美国爱荷华州立大学兽医诊断实验室将 SVA 毒株VP1 和全基因组测序发现，所有新分离毒株之间同源性高达 99%～100%，但是与早期SVA(1988～2001年)序列差异显著[6]。美国SVA毒株与巴西SVA毒株同源性达97%～98%。进化树分析表明，SVA在近30年来已发生变异，致病性增强。

1.3 理化敏感性

目前仍缺少SVV理化敏感性的研究数据。但鉴于SVV与口蹄疫病毒(FMDV)结构特性相近，常认为两者间具有相似的理化敏感性，故消毒时可考虑采用相同的消毒剂和消毒方法。如2%乙酸或醋、0.2%柠檬酸溶液、2%氢氧化钠、4%碳酸钠、醛类、次氯酸盐等，对环境、防护服、车辆等进行消毒。

2 流行病学

2.1 疾病分布范围

1969～2007年，澳大利亚、意大利、新西兰、加拿大、美国等国家曾报道发生特发性水疱性疾病(SIVD)疫情，但并未确诊。2010年，美国印第安纳州一头6月龄的切斯特白野猪出现厌食、嗜睡、跛行，口腔、鼻吻和四肢出现囊泡和糜烂症状，检测能引起水疱症状的口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和猪水疱性疹病毒(VESV)4种OIE要求上报的水疱性疾病病原及相关细菌均为阴性，而SVV为阳性。2014年秋，巴西出现大量仔猪断奶前发病，对病料的检测结果同样排除了其他水疱性病毒病和细菌病，SVV为阳性。截至2015年9 月底，美国有11 个州确诊猪发生SVV感染。加拿大、意大利和巴西疑似SVV感染。2015 年，我国广东某猪场暴发了猪水疱性疾病，表现为感染猪只鼻部和口腔形成溃疡，厌食、跛行，新生仔猪急性死亡，后证实是感染塞内卡病毒所致。从阳性病料中成功扩增获得SVV全基因组，并命名为 CH-01-2015，该病毒与其他8株分离自加拿大、巴西和美国的SVV同源性高达 94.4%～97.1%。

2.2 传染源

病毒以猪作为天然宿主，部分资料显示奶牛也可作为其天然宿主。血清学研究发现，在猪、牛和鼠等动物血清中可见自然SVA的中和抗体。同时，该病毒可以在人视网膜母细胞(PER.C6)、人肺癌单层细胞(NCI-H1299a)和具有神经内分泌功能的肿瘤细胞上生长。I期临床试验结果表明，对人施加1011vp/kg的病毒剂量仍处于安全范围，但暂无人感染该病毒的相关报道。据北美、南美和澳大利亚的研究报道，发病仔猪的多个组织，包括大脑、血液和淋巴组织均含有大量SVA。故猪应视为该病毒的主要传染源。

2.3 传播

虽然同科的FMDV 可以通过直接接触病畜、污染物或气溶胶进行传播，美国和巴西在疑似发病猪场采集的临床样品和环境样品以及鼠粪便、鼠小肠、蝇类飞虫等媒介物中检出SVV，但目前尚无资料显示SVV是否能够通过这些方式传播。该病表现出一定的季节性，多发于春秋两季。

研究报道表明其传播速度较快，如2014年10月至2015年3月的6个月间巴西约70 %的猪场受其影响，2015年7月至11月上旬的4个月间美国约100个猪场发现该病毒。部分报道显示其在宏观上呈低流行性，如美国两所大学的兽医诊断实验室进行的回顾性研究，对来自25个州的441例猪唾液样品使用PCR法进行常规病原体检测，结果显示SVV仅5例，且分别来自5个不同的州，呈低流行性。

2.4 易感动物

根据各国所报道的情况，发病对象均为猪，未见其他物种有感染发病的情况。

3 临床症状

发病成年猪临床表现较为温和，病程约持续1～2周，可出现厌食、昏睡、发热等症状，发病初期可见40℃高烧。鼻吻或口腔黏膜(任何皮肤与黏膜交界处)会出现完整或破裂的小泡，约80%可出现跛行，冠状带和蹄壁周围发红或热烫，出现溃疡性病变。发病仔猪常出现昏睡、精神沉郁，偶见腹泻，体温一般无明显变化。出生0～3日龄死亡率40%～80%，4～7日龄死亡率低于30%。受影响的母猪场出现新生仔猪死亡率的突发性增长，但于4～10d内恢复正常死亡率水平。

4 病理变化

4.1 致病机理

SVV致病机理目前尚不明确。有学者对成年猪感染SVV的发病机制和感染动力学进行了研究，试验动物通过口鼻途径接种SVV SD15-26病毒株，监测其临床体征和病变情况，并通过RT-qPCR法和病毒分离法监测血清中的病毒血症和口鼻分泌物与粪便的排毒情况。此外，还对感染动物在急性感染期间和康复期的病毒载量和组织分布进行了评估。研究结果表明，在人工感染后第4天可观察到以嗜睡和跛足为特征的临床体征并持续2～10d；受感染动物的口鼻和足上均观察到水泡病变，涉及冠状动脉带、悬蹄、蹄趾间隙和足跟、足底等部位；接种后3～10d可检测到短期病毒血症，而在感染后第1～28天从口鼻分泌物和粪便可检测到排毒现象。值得注意的是，对在第38天收集的组织进行RT-qPCR和原位杂交(ISH)检测，结果显示所有感染动物的扁桃体中均存在病毒的RNA片段。与此同时，人工感染5d后通过早期中和抗体的检测对感染动物的血清学反应进行了监测，其结果与病毒血症、排毒情况和组织中病毒含量等水平逐渐降低的情况相符。

4.2 病理变化

猪感染SVV后，除出现上述临床症状外，个别感染案例还可见浆液纤维素性腹膜炎、心包炎，局部广泛性空肠炎和局灶性胃溃疡。通过显微镜观察远端肢体、口腔和鼻吻病变，可见角化、表皮增生、中性粒细胞浸润并伴随纤维蛋白渗出、水肿、急性出血、核碎片，偶见球菌菌落，可导致出现溃疡性胃炎、淋巴浆细胞性肝炎和膜增生性肾小球肾炎。

2015年巴西幼猪感染后的病理学变化包括肾脏点状出血、舌部和冠状带溃疡、间质性肺炎、多灶性白喉样舌炎、淋巴性心肌炎、泌尿膀胱和输尿管过渡性上皮细胞气球样变性和淋巴浆质细胞脑炎。神经症状死亡的仔猪免疫组织化学方法(IHC)检测发现，病毒分布于脑部脉络层的上皮细胞和周围血管内皮细胞中，推测可能是通过改变血管上皮细胞的完整性，进而感染神经脉络层，随后传递到相邻的神经纤维网，从而导致神经症状的产生。同时，IHC 结果表明，所有感染仔猪的尿道上皮细胞中均能检测到该病毒，提示尿液可能是该病的一种传播方式和猪场感染的污染源。此外， RT-PCR和IHC检测发现病毒存在于腹泻仔猪的肠道，表明病毒可以在肠道上皮细胞增殖。该研究表明，SVV是一种泛嗜性病毒，在感染早期可造成多系统性疾病。

5 诊断

由于 SVV感染动物所引起的临床症状与其他病毒感染(如FMDV、SVDV、VSV、VESV)引起的临床表现十分相似，给临床确诊带来了困难。因此，需要对疑似病例进行实验室诊断。目前该病的主要实验室诊断方法包括血清学诊断和病原学诊断。

5.1 血清学诊断

最初通过iELISA(间接ELISA)对血清中的SVV抗体进行检测，但iELISA存在较强的交叉反应且特异性不高，目前已被cELISA(竞争ELISA)替代。cELISA 是通过待测抗体与预先制备的抗SVV单克隆抗体(MAb)竞争结合SVV抗原，评价待测抗体的效价。该方法近年来在美国猪群SVV流行病学监测和实验室确诊工作中被广泛使用。

血清中和试验具有特异性高的特点，广泛应用于血清学调查。病毒中和试验采用终点稀释法测定血清中抗体的中和活性。将热灭活的血清进行2倍系列稀释，与100 TCID50的SVV等体积混合，在37℃孵育1h，感染NCI-H1299 细胞，感染72 h 后观察细胞病变，当90%～100%的细胞病变得到抑制则判定中和实验有效，从而确定阳性抗体最终稀释度，计算抗体效价。

5.2 病原学诊断

相关研究表明SVV可在猪睾丸细胞(ST细胞)、猪肾细胞(PK-15)、人胚肾细胞(PER.C6)和非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)中分离培养。电子显微镜检查、免疫组化、RT-PCR、荧光定量RT-PCR等均可用于SVV分离培养物的鉴别检测。其中，电子显微镜检查可通过是否出现单个或聚团的二十面体结构颗粒，确定是否存在病毒感染。免疫组化试验是抗原检测敏感且特异的方法，能定位病原在组织细胞中的分布。试验通过RT-PCR 扩增SVV基因组特定区段(如VP3/VP1, 3D/3′非编码区)，可对猪水泡样本中的SVV核酸进行检测。RT-PCR和荧光定量RT-PCR技术通常具有特异性高、敏感性强、快速可靠的优点，广泛应用于分子生物学检测[7]。

同时，新型RNA原位杂交技术是用于SVV快速诊断的一个有效手段。原位杂交技术可以检测组织切片中特异的RNA或DNA序列。目前已有学者使用新型的原位杂交RNA-based 显色技术(RNAscope)与杂交信号放大系统相结合来检测SVV，探针靶向SVV的VP1基因[8]。感染动物的皮肤、脾脏、肝脏、心脏、小肠和淋巴结等组织经福尔马林固定后的石蜡包埋样品适于进行原位杂交检测。

2015年巴西新生仔猪SVV感染病例研究结果表明，来自感染仔猪舌头、牙龈、胸部皮肤破裂水泡、冠状带溃疡、心肌、肺、肝、脾、肾盂、膀胱、大脑、小脑、脑干、带粪小肠等样品使用RT-PCR方法可检出病原核酸。来自感染仔猪舌头、牙龈、肾盂、脑、膀胱、带粪小肠等样品免疫组化检验呈阳性。

6 防控措施

现有研究资料显示SVV不具备FMDV的危害性，大多数成年猪感染后预后良好，未引起严重的公共卫生后果和经济损失。但SVV感染的临床症状类似于FMD、SVD、VS等动物水泡性疾病，使得感染猪只的上市存在重大的风险和隐患[8]。虽未有确切数据能够对SVV的传染性进行综合分析，全球范围对其认知也相对局限，其对于猪场的短期或长期影响暂无法准确估量，但近年来该病在巴西、美国、加拿大、中国等地几乎同时发病。表明其从被发现至今存在进一步扩大和爆发的可能，且局部地区传播速度快，仔猪致死率较高，发病区域的环境、媒介、生物大多可检测到携带病毒[9]。

目前，世界动物卫生组织(OIE)尚未将该病列入疫病名录，其网站也未发现该病的任何信息。据报道，美国加州已就此启动专项监测项目，美国农业部也规定发现动物出现水疱性临床症状后，应立即与当地州兽医部门联系，在调查结果确认前暂停农场一切动物移运。其他国家关于SVV和PIVD的相关限制防治或限制措施，所查阅资料暂时尚未发现[10]。我国虽已发现该病，但研究资料不多，诊断方法不成熟，缺乏有效疫苗。我国农业部制定的《2018年兽医工作要点》中已明确提出做好塞内卡病毒病等新传入疫病的防治工作。有关部门应密切关注国际疫情动态，做好风险评估和预警预报工作。同时，加强疫病监测，加快疫苗的研发，建立诊断技术，做好技术储备，制定相应的应急预案。因该病在临床上与给养猪生产造成巨大威胁的FMD 症状极为相似，发现相似疫情，应及时做好与FMD、SVD、VES及VS的鉴别诊断[11]。一旦确诊发生疫情，建议由地方兽医主管部门开展紧急调查和抽样检测，在调查结果确认前暂停相关养殖场的动物移运。确认后可参照口蹄疫防控技术规范和防控应急预案果断处置。