间充质干细胞与呼吸道变应性疾病的相关研究进展

阚晓丽，李泽龙，王 予，陈颖坤，王严影，曹现宝※

(1.昆明医科大学研究生院，昆明 650500； 2.成都军区昆明总医院 a.耳鼻咽喉颌面外科b.临床实验科，昆明 650032)

近年来，呼吸道变应性疾病的发病率呈上升趋势，尤其是变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)、哮喘等严重威胁人类健康[1]。呼吸道变应性疾病的发生发展伴随复杂的病理改变，目前还未发现能够彻底治疗该类疾病的相关药物或技术。但可以确定呼吸道变应性疾病属Ⅰ型变态反应，主要包括早期炎症级联反应和后期迟发相反应，其中各型免疫细胞的活化是促进疾病发生、发展的病理生理基础。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多功能干细胞，已在骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带和肌肉等组织的损伤修复方面表现出治疗潜力。越来越多的动物实验和初步临床试验证据表明，MSCs不仅具有多能分化潜能，还可通过与T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)的相互作用表现出强大的免疫调节潜能[2-3]。MSCs对机体的免疫调节作用使其成为治疗变应性疾病的理想药物，通过调节免疫细胞的活化，抑制变态反应，从而控制疾病进展。现就近年来MSCs与呼吸道变应性疾病的相关研究进展予以综述。

1 MSCs调节T淋巴细胞的增殖和功能

T淋巴细胞是细胞免疫的主要执行者，在促进变态反应过程中发挥重要作用。研究表明，MSCs可调节T淋巴细胞的增殖，参与免疫炎症反应的调节。Giuliani等[4]发现，当骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)与T细胞共培养时，BM-MSCs可通过抑制T细胞进入细胞周期而影响T细胞增殖，并能有效地诱导白细胞介素(interleukin，IL)10的产生，促进T细胞的凋亡。Lim等[5]对延迟型变态反应(delayed-type hypersensitive，DTH)小鼠模型的研究发现，MSCs往往优先聚集在引流淋巴结的副皮质区及生发中心的边缘处，并以剂量依赖性方式诱导引流淋巴结周围免疫细胞的凋亡来减弱DTH。DTH过程中，炎症反应区域T细胞的浸润明显减少，而引流淋巴结中T细胞的凋亡显著增加；进一步研究发现，MSCs引起T淋巴细胞凋亡的机制与其对一氧化氮的诱导有关，表明MSCs可通过直接影响T淋巴细胞的增殖与凋亡，抑制炎症反应，减轻局部组织损伤。

2 MSCs调节B细胞的增殖和功能

早期为研究MSCs对B淋巴细胞的相互作用，Corcione等[6]将人BM-MSCs与B淋巴细胞共培养发现，BM-MSCs能直接将B淋巴细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制其增殖；进一步实验发现，BM-MSCs发挥上述作用与其抑制免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M、IgG和IgA的分泌，下调CXC趋化因子受体4、CXC趋化因子受体5、CC趋化因子受体7、CXC趋化因子配体12和CXC趋化因子配体13的表达有关。在粉尘螨诱导的小鼠特应性皮炎的实验研究中发现，人脂肪来源MSCs可以显著促进特应性皮炎小鼠毛发生长，并以剂量依赖性方式抑制病变处表皮增生和B淋巴细胞浸润，降低血清IgE水平；并在随后进行的共培养实验中发现，人脂肪来源MSCs通过抑制环加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)信号通路实现对B淋巴细胞增殖和成熟的抑制[7]。另有相关研究发现，人类脐带及脂肪来源的MSCs均具有抑制B细胞增殖和分化的作用。可见，不同组织来源的MSCs均可通过抑制B细胞的增殖和分化来调节炎症反应[8-9]。

3 MSCs对DC的作用

MSCs对先天或后天免疫细胞均有抑制作用，DC是其中之一。在葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型的研究中，腹腔注射从模型小鼠脾脏分离出的DC能够加剧溃疡性结肠炎模型小鼠结肠的炎性病变，而BM-MSCs处理组小鼠脾脏分离出的DC则能显著降低炎症活动指数，改善组织病理学评分；进一步实验发现，BM-MSCs可通过升高半乳糖凝集素3的表达，降低DC中IL-1β、IL-12和IL-6的浓度，并降低其膜表面抗原呈递分子的表达[10]。除间接作用外，MSCs还能以直接接触的方式抑制DC功能。Alidinucci等[11]发现，MSCs与DC接触可改变其细胞骨架组织干扰激活过程，使DC在扩增的同时保留未成熟的特征，从而无法有效参与T细胞的免疫调节。而Spaggiari等[12]的研究发现，MSCs存在的条件下，即使补充外源性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和IL-4也不能使从外周血分离出的单核细胞中获得典型成熟的DC表型并产生促炎介质IL-12，更不能诱导T淋巴细胞活化或增殖，证明MSCs具有抑制早期DC成熟的作用。综上所述，MSCs除间接或直接接触方式对DC的调控外，还可通过抑制DC的成熟，进而抑制下游炎性通路的活化。

4 MSCs与NK细胞的相互作用

MSCs与NK细胞的相互作用及其机制对MSCs的推广应用至关重要。Najar等[13]通过共培养包皮间充质干细胞(foreskin mesenchymal stromal cells，FSK-MSCs)和NK细胞验证其相互作用的研究发现，NK细胞的活化对FSK-MSCs表现出不均匀的细胞毒性，最终导致其死亡。丝氨酸蛋白酶抑制剂是机体中丝氨酸蛋白酶的活性调控因子之一，可调节生物体中许多重要的生命过程(补体激活、炎症和细胞迁移等)。在激活的NK细胞中，FSK-MSCs介导的C1和B9丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达明显降低。此外，FSK-MSCs能抑制NK细胞的增殖，但却增加了γ干扰素和肿瘤坏死因子α的表达，并增强NK细胞的去颗粒化作用以及穿孔素和颗粒酶的分泌。Giuliani等[14]的研究同样证实了MSCs对NK细胞增殖和溶解细胞功能具有显著的抑制作用，MSCs可通过下调不同激活标记和细胞外信号调节激酶1/2信号的表达，阻断NK细胞的细胞溶解机制，从而使其与靶细胞形成免疫突触，并分泌细胞毒物颗粒。其他类似研究也显示，脐带来源的MSCs与NK细胞接触可引起IL-1途径活化，随后引起前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的大量分泌，导致NK细胞活性降低，并抑制其细胞毒作用[15]。由此可见，MSCs对NK细胞具有双重作用，可通过多种机制抑制NK细胞活性，降低细胞毒作用，抑制炎症反应；并在一定程度上增强γ干扰素等因子的表达，发挥一定的促炎作用。

5 MSCs与呼吸道变应性疾病

呼吸道的变应性疾病主要包括上呼吸道的AR和下呼吸道的哮喘，上呼吸道和下呼吸道解剖学上的连贯性导致AR与哮喘经常共存，称为联合气道疾病[16]。近年来的研究也发现，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的发病机制也与变态反应性炎症有关[17]。

5.1AR AR是一种慢性复发性过敏性炎症，由变应原接触过度激活的辅助性T细胞(helper T cell，Th)2引起，主要表现为流鼻涕、鼻痒、打喷嚏和鼻塞。病理组织学显示，活动性AR患者的鼻黏膜上皮内可见肥大细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞的浸润，深部固有层也可见嗜酸粒细胞的积累[18]。随着时间的推移，可出现网状基膜的轻微增厚，较哮喘的下呼吸道黏膜轻微，病变范围也较局限。

卵清白蛋白诱导的AR小鼠模型的相关研究发现，MSCs治疗可使小鼠从大多数过敏性的病理改变中获得保护，包括抑制炎性细胞浸润和肺部黏液生成，减少鼻内嗜酸粒细胞浸润，减少支气管肺泡和鼻腔灌洗液中的炎性细胞浸润[19-22]。MSCs治疗后AR小鼠血清中Th2细胞分泌IgE以及细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平均明显降低。Li等[23]在AR大鼠实验中观察到，与对照组相比，MSCs除可抑制鼻腔黏膜中的组胺表达和巨噬细胞聚集外，还能显著降低大鼠血清中IL-4、肿瘤坏死因子、IgE等的水平。为了进一步验证MSCs在AR患者中的作用，Fu等[24]提取AR患者外周血单核细胞，将其与不同细胞来源的MSCs进行共培养发现，各类MSCs不仅能抑制外周血单核细胞、淋巴细胞增殖，还能阻滞G1期T淋巴细胞的分化，从而抑制T淋巴细胞的成熟；进一步研究发现，MSCs可通过诱导调节性T细胞反应抑制T细胞表型向Th2细胞转化，显著降低Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的产生，表明MSCs的管理可抑制Th2免疫反应，减少鼻腔及气道黏膜炎性细胞浸润，有效降低AR的过敏症状和炎症反应参数，可作为AR的临床治疗方法，用于治疗过敏性气道疾病。

5.2哮喘 哮喘是一种慢性炎症性下呼吸道疾病，主要表现为可逆的气流阻滞、气道高反应性和间歇性呼吸反应性症状，包括喘息、咳嗽、呼吸困难和胸闷。哮喘患者气管支气管树发生的炎症和结构改变称为重塑。目前，普遍认为慢性嗜酸粒细胞性炎症是重塑发生的先决条件[25]。气道分泌物异常会导致哮喘的病理过程，尤其是严重的、危及生命的恶化。少数病例的死亡被认为是气道内顽固黏稠的黏液与炎症性嗜酸粒细胞渗出物混合导致的窒息所致。

MSCs在治疗哮喘及并发症方面具有重要作用。Li等[26]通过MSCs治疗大鼠哮喘模型进行研究发现，移植MSCs的大鼠淋巴、外周血和肺组织标本中IL-10、叉头状/翅膀状螺旋转录因子和调节性T细胞水平均显著升高；与对照组相比，移植MSCs大鼠肺组织中叉头状/翅膀状螺旋转录因子蛋白质水平有所增加，而IL-17、维甲酸孤儿核受体家族γt和Th17减少，炎性细胞浸润也减少。近年来，关于MSCs治疗小鼠哮喘模型的研究较多，通过溴脱氧尿苷标记BM-MSCs对卵蛋白诱导的小鼠哮喘模型进行治疗发现，哮喘组较对照组的组织病理学改变更加明显；白细胞计数及嗜酸粒细胞的比例亦明显升高；在接受BM-MSCs治疗的小鼠肺中可见大量含溴脱氧尿苷的BM-MSCs沉积，BM-MSCs治疗可显著降低气道病理指标、炎性细胞浸润以及杯状细胞增生[27-29]。Han等[30]用带有促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)基因的慢病毒载体转染MSCs，成功构建EPO-MSCs并用于治疗发现，EPO-MSCs对哮喘局部气道炎症及肺组织IL-4、IL-5、IL-13水平的抑制作用强于MSCs；与哮喘组相比，治疗组巨噬细胞的数量、平滑肌层厚度、胶原密度、增殖细胞核抗原阳性间充质细胞和血管性血友病因子阳性血管的数量均明显受到EPO-MSCs的抑制，且EPO-MSCs还下调了肺组织中转化生长因子β1的表达，并活化转化生长因子β激活激酶1和p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)的信使RNA(message RNA，mRNA)和蛋白水平。以上研究表明，MSCs能调节Th17/调节性T细胞平衡，减少炎性因子生成，有效降低呼吸道炎性细胞浸润，达到改善气道高反应性和调节气道重构的目的，且EPO-MSCs可更有效地减弱哮喘气道重塑。

为进一步深入探讨MSCs治疗哮喘的机制，Tang等[31]采用微RNA(microRNA，miRNA)聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)阵列分析MSCs治疗前后哮喘小鼠体内RNA的改变发现，共有296个miRNA在诱导哮喘和BM-MSCs治疗后表达不同，其中14个miRNA在哮喘诱导和BM-MSCs移植之间呈现反向变异趋势，通过增加样本进一步证实了mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-449c-5p和mmu-miR-496a-3p在实时定量PCR表达不同；同时发现了19个与诱导过敏和BM-MSCs治疗有关的基因，目标基因的分析显示，mmu-miR-21a-3p与免疫调节剂活化素受体2A(activin receptor type 2A，Acvr2a)显著相关，且在哮喘和BM-MSCs治疗后与Acvr2a相关抗体表达相反；双荧光素酶试验报告也显示，mmu-miR-21a-3p对Acvr2a的转录呈负性调控；此外，has-miR-21a抑制剂显著增加了脂多糖刺激下人正常肺上皮细胞Acvr2a的mRNA表达。在此之后，Lin等[32]通过mRNA PCR芯片检测发现了47个蛋白编码mRNA表达差异，分级聚类分析证实包括趋化因子配体11、嗜酸粒细胞趋化蛋白2、IL-13、IL-33和嗜酸粒细胞相关的核糖核酸酶A家族成员11等5个mRNA在哮喘模型诱导后显著上调，经MSCs处理下调。哮喘诱导和MSCs治疗后有不同miRNA和mRNA的表达，而这些RNA是变态反应和MSCs介导的免疫调节的潜在靶点。

5.3COPD COPD是临床常见的慢性呼吸道疾病之一。吸烟是目前公认的最重要的病因，但近年研究结果显示，气道高反应性与循环中免疫细胞的改变与该疾病的发生、发展密切相关[33-34]。临床研究也观察到，与正常人群相比，部分COPD患者血清中嗜酸粒细胞和中性粒细胞比例往往呈升高趋势，且升高程度与疾病的预后呈负相关[35-36]。可见，过敏性炎症反应与COPD存在潜在相关性。

大量动物模型显示了MSCs在COPD动物模型中的保护和修复作用。通过香烟烟雾诱导大鼠肺气肿模型研究发现，经尾静脉MSCs移植可阻断肺气肿的进展，降低细胞凋亡，调节机体氧化应激[37]。而Gu等[38]实验研究发现，MSCs通过下调COX-2和COX-2介导的PGE2生成可减轻气道炎症和肺气肿，之后通过体外共培养实验证明，抑制p38 MAPK和细胞外信号调节激酶的活化及相关磷酸化可下调巨噬细胞COX-2/PGE2的分泌。Song等[39]的研究显示，经过MSCs治疗的模型大鼠支气管灌洗液中中性粒细胞和淋巴细胞的百分比较未经处理组(对照组)明显降低，且支气管周围及肺泡结构的感染细胞浸润较少。对COPD模型小鼠治疗前后进行基因表达谱分析发现，长期暴露于香烟烟雾的小鼠经过MSCs系统注射后，具有氧转运和抗氧化功能的基因Hbb及Hba增加，血清蛋白酶抑制剂在相应的时间点也有所增加[40]。可见，MSCs一方面可通过抑制肺泡巨噬细胞中的COX-2/PGE2或p38 MAPK和细胞外信号调节激酶通路，减轻COPD动物模型中的气道炎症；另一方面，也可通过降低中性粒细胞及嗜酸粒细胞水平，减少机体氧化应激反应，阻断肺气肿的进展，进而恢复部分受损的肺功能。

临床前的体内外研究都证明了MSCs可有效治疗COPD。为进一步验证MSCs治疗的安全性及有效性，De Oliveira等[41]进行MSCs联合单向支气管内瓣膜置入术(one-way endobronchial valves，EBV)治疗肺气肿Ⅰ期临床试验发现，EBV+MSC联合治疗并没有导致急性给药相关毒性、严重不良事件或死亡的发生；两组所有不良事件、COPD加重的频率或疾病恶化的发生率比较差异无统计学意义；此外，患者在血液检查、肺功能或放射学结果上也无统计学意义；且与EBV治疗相比，EBV+MSC治疗的生活质量指标更高，在30～90 d内,患者的循环C反应蛋白水平下降，BODE(B：体质指数，O：气道阻塞，D：呼吸困难，E：运动指数)和改良版英国医学研究委员会呼吸困难问卷评分下降，说明MSCs治疗是安全的，MSCs管理能够减少系统炎症和COPD预测因子，并在治疗后改善患者的生活质量。

6 小 结

随着社会经济发展和空气污染的加重，呼吸系统疾病问题越来越突出，寻找更有效的治疗迫在眉睫。MSCs的免疫调节功能给呼吸系统相关变应性疾病的治疗带来了希望，为这类疾病的治疗提供了新的策略。目前大量研究表明,MSCs在治疗呼吸道变应性疾病上有较好的作用，但绝大部分集中在动物实验方面，MSCs的给药剂量、治疗频率以及潜在的作用机制仍有待进一步阐明[42]。此外，关于现实中MSCs治疗的应用还需要进行创新和改进，如制订合适、严格的MSCs基础治疗规范和标准，以成为未来患者更有效、更安全的治疗选择[43]。