修饰生物材料促进骨组织工程血管化研究进展

李 婧，王怀明

(解放军第八九医院骨科实验室，山东 潍坊 261021)

创伤或疾病导致的大段骨缺损仍是矫形外科面临的重要难题之一。骨组织工程技术是促进骨再生、修复骨缺损的重要方法，也是攻克这一难题的希望。骨组织工程血管化在骨再生和骨缺损修复中的重要性一直都是研究热点[1-2]。血管系统在骨发育、再生和重塑中不可或缺。骨再生的关键在于快速恢复血管系统，实现合适的血液供应，从而促进骨整合和骨缺损的修复[3-5]。骨组织工程技术一般由生物材料支架、生物活性因子及移植细胞3个基本单元组成，其中生物材料支架是核心，为骨缺损部位提供机械稳定性，还可作为生物活性因子及移植细胞的转运载体，是实现生物活性因子时空调控和动态影响血管重新生成的关键组分。从材料组成、表面功能化、机械性能及装配技术等方面构建和修饰生物材料，可进一步促进生物材料与生物活性因子以及移植细胞的协同作用，有利于血管生成应答的产生[6-8]。现就近年来生物材料促进骨组织工程血管化的研究进展予以综述。

1 改进材料组分促进血管生成

1.1生物活性玻璃(bioactive glasses,BGs) 可刺激血管化骨生长是生物材料支架完全替代骨移植的前提。BGs是较为理想的材料，其在生物医学中的应用已被广泛研究[9-11]。BGs本身较脆，但具备骨组织工程所必需的重要特点。BGs具有骨传导性，可比其他生物陶瓷更快地与宿主组织键合，并在交界处形成羟磷灰石样表层，类似于骨的矿物质成分，从而与活体骨和组织结合更加牢固。BGs降解后释放的溶出产物能在遗传水平刺激成骨祖细胞，促进成骨作用[12]。此外，有研究显示BGs能促进血管生成，对骨再生中新血管形成和软组织损伤愈合十分重要，可以替代昂贵的促血管生成因子的应用。Lee等[13]将BGs纳米颗粒融入磷酸钙水泥中，发现随着纳米颗粒浓度的增加，细胞黏附、增殖和分化能力增强，并能激活一系列血管生成相关基因的表达，显著影响内皮细胞的迁移和血管形成。与磷酸钙材料相比，BGs在烧结过程中发生结晶作用，不易制成多孔性结构是限制其应用于临床的重要原因，而多孔性支架是促进血管生成的重要因素。以往的研究主要是改进机体对BGs的应答，使其作用更广泛。通过调整BGs组分可以预防结晶形成，可制备BGs与聚合材料的复合体或采用新型加工过程，使BGs材料更坚硬，从而制备出不同机械性能的支架，用于不同负重骨的替代治疗。Midha等[14]研制的由70%二氧化硅和30%氧化钙组成的BGs多孔支架可被破骨细胞重塑；从该支架中释放的可溶性二氧化硅和钙离子能使成骨细胞数量增加，且材料表面能支持内皮细胞生长和血管形成，具备致血管生成潜力。因硼酸盐BGs降解速率可控，作为移植物可以更好地匹配新骨形成速率，故研究者也尝试用硼酸盐或硼硅酸盐复合物代替硅酸盐构建新型BGs材料，提高新骨形成能力。此外，BGs中还可以掺入铜、锌、锶等微量元素，更有利于健康骨的生长；或者用2%或5%的钴离子替代部分钙离子，可制备出模拟低氧的BGs使接种的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中低氧诱导因子和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因表达增加，并且能分泌VEGF[15]。

1.2产氧生物材料 氧气不足是工程化组织中细胞死亡或功能丧失的主要原因，不可避免地导致移植后血管生成延迟，故应设法提高移植物中氧气水平，尤其是早期移植阶段和血管网络形成之前，可同时维持细胞活力。生物材料本身具备理想的产生氧气能力，无需多次手术，在移植后立即提供足够的氧气。例如无机过氧化物(如过碳酸钠、过氧化钙和过氧化镁等)浸泡过的生物材料在体内可通过水解作用直接产生氧气[16]。Harrison等[17]合成了一种包含过碳酸钠的乳酸羟乙酸多聚物(lactic-co-glycolic acid，PLGA)膜，将该膜移植到小鼠皮瓣上，1周内组织坏死和细胞凋亡显著减少。但PLGA膜可水解降解，无法调控氧气产生速率且以过氧化氢作为媒介，而高浓度过氧化氢对细胞及周围组织有害，故仍需补充过氧化氢酶来缓解细胞毒性，因此不能作为良好的对自由基敏感的细胞载体。Shiekh等[18]制备了含有过氧化钙和抗氧化剂的聚氨酯支架，能持续释放氧气达10 d，并可减少自由基的产生，可维持细胞在低氧状态下存活，防止组织坏死。Pedraza等[19]尝试将固体过氧化钙包埋在高度疏水性且稳定的聚二甲基硅氧烷中，通过限制水进入生物材料实现对氧气产生的调节。聚二甲基硅氧烷的氧扩散和渗透性极高，可保证氧气有效地从材料中扩散并进入周围环境中。体外研究显示，该材料可显著缓和低氧诱导的细胞死亡和功能丧失，并限制细胞应激通路的活化和无氧代谢的转化，在未使用任何自由基清除剂或过氧化物清除剂的前提下，维持细胞存活达3周。

1.3生物材料表面功能化 生物材料表面直接与周围环境接触，材料的表面能量、电荷及粗糙度等性质决定了两者的相互作用。对生物材料表面进行特定地修饰可赋予生物材料亲水性、生物识别、细胞相容性等特质，提高在生物环境中支架材料、生物活性因子和细胞的交叉作用效果，有利于组织再生。表面功能化的方法主要有以下几种：①共价结合细胞黏附配体，通过配体与相应受体之间特异的相互作用提高机体获得有效应答的能力。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽序列是常用的黏附配体，既可提高细胞的黏附增殖，又可结合生物活性因子。②选择特定的功能基团或生物分子固定在材料表面，通过调节亲水性/疏水性的平衡提高材料界面与周围环境的趋近性。③表面磷酸化是表面功能化的有效方法，有利于骨键合，促进新骨形成。羧基、磷酸基团、氨基、羟基等阴离子功能团对生物材料表面的修饰能诱导磷酸钙相的成核作用和羟磷灰石的生长。随着对细胞和材料间相互作用机制研究的进一步深入，有学者提出了智能界面或智能支架等概念，通过多种途径和方法精确合成生物材料，使其呈现高度特异空间分布的生物活性位点和理想的表面形态结构，从而激发独特的细胞应答，比传统材料更有利于原位诱导成骨细胞分化及促进血管生成[20-22]。

2 调控促血管生成因子释放

生物材料作为生物活性因子的载体，在行使转运功能的同时，可从时间和空间上调控生物活性因子在体内的定位及活性，参与促血管生成作用和成骨作用，对获得更好的治疗效果十分重要。生物活性因子可通过物理包裹或化学固定的方式加载到生物材料上。生物材料可通过特定修饰适应不同因子的需要，兼容不同释放机制智能调控生物活性因子的体内功能[23]。

2.1扩散释放 扩散释放一般采用物理包裹的方式转运生物活性因子。根据操作的难易程度分为浓度梯度释放和序贯释放。浓度梯度释放易于操作，将生物材料支架在生物活性因子溶液中浸泡至饱和后立即植入生物体内或将生物活性因子包埋在材料中，移植后生物活性因子沿浓度梯度快速脱离支架，扩散进入周围组织。其释放动力学取决于生物材料与生物活性因子之间的非特异性相互作用以及材料的孔隙大小、结构和降解性。这些方法在早期报道的实验结果中被证明可实现骨修复。通过调节孔径大小等方式可更加精细地构建材料支架，制备不同活性因子与材料的配对组合，实现特定生物活性因子的快速释放，但释放时间和空间定位方面难以调控。移植初期活性因子一次性突然释放，难以实现大多数情况下需要生物活性因子持久释放的目的，对于半衰期较短的生物活性因子，有时需要提高初始剂量，但会增加不良反应的产生风险。

血管形成是由一系列事件构成的，成熟血管网络形成需要许多促血管生成因子的精确调控才能实现。除了定向转运一种生物活性因子外，同时或序贯转运多种因子将会提高治疗效果。有研究者尝试将生物活性因子包裹在可降解微粒中，制成纳米胶囊，来实现生物活性因子的序贯释放。Perez等[24]以胶原蛋白为核心、藻酸盐为外壳，设计了一种水凝胶纤维支架。将骨形态发生蛋白2(bone morphogenic protein 2，BMP-2)加载于核心层，钴离子加载于外壳中，并且根据需要可以灵活调整钴离子浓度。结果表明，在血管生成中发挥作用的钴离子在1周内快速释放，为早期血管生成创造条件。而成骨因子BMP-2则可以在几周至几个月的时间内持续释放。Bai等[25]利用超临界二氧化碳发泡技术制备了一种新型聚合物系统，可以序贯转运VEGF、成纤维生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF-2)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)三种参与血管形成的因子，可从剂量和速率方面调控 3种因子的释放，并显著增强内皮细胞的致血管生成作用以及成熟血管网络的快速形成。

2.2降解释放 生物材料的降解动力学直接决定了所转运生物活性因子的释放动力学。水解和酶解是生理条件下两种主要降解方式。生物材料的分子量、聚合物的浓度和疏水性、交联度、膨胀度、pH变化、机械压力或拉伸作用等因素均能影响材料的降解。水解作用能以相同速率在机体不同部位发生，故难以实现时空上的精确调控。利用细胞分泌酶的活性可实现生物活性因子的特定释放。在生理条件下，血管损伤后血小板、中性粒细胞和巨噬细胞迅速到达损伤部位，形成富含纤维蛋白的临时基质，其中包埋着生长因子。当基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)发挥作用降解临时基质时，结合在细胞外基质(extracellular matrix，ECM)上的生长因子即被释放，用来调控周围细胞的切口愈合和局部血管的重新形成。酶的局部浓度决定了酶解的结果，在时空上调节ECM的降解和存在，从而调控周围环境中生长因子的浓度。根据这一生物激活策略构建模拟ECM的生物材料支架，通过对局部环境信号或外源性刺激产生应答，能够适当控制促血管生长因子在骨缺损部位的存在，实现按需释放。有研究显示，MMPs敏感性水凝胶可显著提高BMP-2修复大鼠颅骨缺损的效果[26-27]。合成的MMPs敏感性水凝胶较目前临床上使用的可吸收胶原海绵在加载BMP-2修复临界大小骨缺损方面的效果更好。用MMPs配体功能化生物材料偶联促血管生成因子，可按需释放因子，诱导血管生成[28-29]。

2.3延缓释放 在许多组织再生应用中，再生区域细胞持续暴露于含有特定可溶性活性因子的微环境并发生特定的细胞行为或形态发生事件，导致生物活性因子的持续呈递，促进新组织生长。生物活性因子以一定速率的持久释放，既可减少初始剂量、降低不良反应发生率，又可保证生物活性因子在整个修复过程中始终以适当浓度发挥作用。主要方式：①依靠亲和力和非共价结合力(静电作用、氢键、范德华力或疏水性作用等)，实现因子的持久释放。用于骨组织再生的常用生物活性因子(BMP-2、FGF-2和VEGF)在生理pH条件下带正电荷，可以与带负电荷的生物材料形成多离子复合物。这种静电作用可延缓生物活性分子的扩散，成为建立可调控转运系统的基础。同样，在生理pH下带负电荷的DNA常与阳离子复合物结合形成带正电荷的颗粒，从而延缓DNA从带电荷生物材料基质中释放。②利用生物活性因子与肝素及其衍生物的亲和作用构建延缓释放系统。存在于ECM中的肝素是富含负电荷的硫酸化分子，能结合多种促血管生成因子和成骨生长因子(如BMP-2、PDGF、FGF-2和VEGF)。利用工程技术将肝素结合域共价结合在支架材料上，通过亲和作用调控生物活性因子的释放和活性[30-31]。故可对某些生物材料进行硫酸化修饰，赋予其结合生物活性因子的能力，使其具有与肝素相同或更高的亲和力，增强生物活性因子介导的体内血管生成作用。Janse van Rensburg等[32]利用肝素共价修饰聚乙二醇凝胶可持续释放肝素，其血管形成能力优于不含肝素和非共价结合肝素的聚乙二醇凝胶，并能显著增强生长因子的血管形成能力。Freeman等[33]研究硫酸化修饰对藻酸盐支架转运的促血管生成因子作用的影响，结果表明，硫酸化藻酸盐支架组的血管密度和成熟血管比例较对照组高3倍以上。

3 调节材料强度促进细胞定向分化

干细胞具有多能性，是骨组织工程中常用的移植细胞。除生化信号外，干细胞的维持和分化也受到微环境中生物物理因素的调节，包括机械负载和材料性质等[34-35]。随着生物模拟材料的发展，出现了更多有关ECM机械强度影响干细胞自我更新和行为的证据。通常用弹性模量表示ECM强度，不同弹性模量的材料指导干细胞分化成不同种类的细胞。Zouani等[36]对不同强度支架上BMP-2对干细胞调节的研究发现，MSCs对不同强度水凝胶的应答存在差异，导致细胞分化方向不同。同时，生长因子的存在可调节机械信号对干细胞的作用。

目前认为，ECM与干细胞相互作用的媒介可能与整合蛋白有关。整合蛋白是由α和β亚基组成的异二聚体，每种亚基又分为多种类型。这些亚基对各种ECM蛋白的亲和力和特异性存在差异，故在调节干细胞对微环境机械性质的应答中也发挥不同的作用[27,37-39]。整合蛋白作为干细胞感知材料强度的开端，在机械信号转导中尤为重要，既可将细胞外环境信号转入细胞内，又可将细胞内信号转运到细胞外，使得材料强度引发的多种信号之间的交叉作用影响基因表达并决定细胞命运[40]。因此，可以工程构建生物材料并通过活化整合蛋白的途径实现血管生成。Lin等[41]在特定培养基中对通过改变各组分浓度制备的不同强度和孔隙度的明胶-异丁烯酸水凝胶接种MSCs并诱导内皮分化的研究发现，强度较低的凝胶(7.5%和10%)上MSCs内皮细胞标志物信使RNA表达显著高于强度较高的凝胶(15%)；组分浓度为10%的凝胶上MSCs成骨标志物信使RNA表达水平最高，可为MSCs形成毛细血管样结构提供最佳条件，表明材料的机械性质能影响MSCs的内皮分化和成骨分化以及随后的毛细血管样结构形成。

4 显微装配技术

支架材料的显微结构在血管形成中发挥重要作用，如更高孔隙度和更大孔径允许体内骨长入和血管形成，支架的平均孔径与物质转运及细胞黏附相关。因此，构建含有不同孔径大小的微孔支架有利于骨形成和血管形成。天然组织基质是由孔、纤维、脊、沟、凹等纳米特征构成的复杂结构。研究证明，ECM的表面特征能显著影响细胞的黏附、增殖、排列、迁移和分化，其中微米级表面特征可以控制细胞形状和定位，纳米级表面特征以纤维直径、长度和交联样式及表面不规则性等方式为细胞提供几何学刺激信号，从而调节细胞与基质间的相互作用[42]。纳米结构催生纳米技术成为组织工程和再生医学的重要研究领域。应用显微纳米装配技术可制备出更加精细复杂的支架材料，更好地模拟天然ECM的功能[43]。

4.1电喷技术 电喷技术是一种从聚合物溶液中获得纳米纤维的新技术。用于组织工程的优势主要有：①表面积与体积的比值高。②结构、功能和形态类似胶原纤维，但无导致生物污染的风险。可人为调控获得不同结构和形状的纳米纤维，效仿天然ECM，为细胞长入和骨再生提供更有利的微环境。不足之处是在构建结构更复杂的支架方面仍欠缺灵活性。Lü等[44]在PLGA电喷支架表面用肝素固定VEGF，实现VEGF的持续释放，且与血管内皮细胞一起增强MSCs的血管生成。Jundzi等[45]利用电喷技术构建管形合成聚合物支架的动物体内实验结果显示，植入腹膜后有更多更大的血管形成并迁移进入支架内，无炎症反应发生，支架与宿主组织整合更好。

4.2逐层装配技术(layer-by-layer assembly，LBL) 为了满足生物材料同时具有诱导血管生成和成骨作用的需要，研究者提出了构建分层支架的概念[46]。分层支架使每层转运不同信号，在不同区域分别递呈不同生物活性因子，相较于简单混合各种生物活性因子的方式，能更好地评估不同生化信号的作用。LBL是一种制备基于膜组分互补作用的多层膜的自我装配技术。相较于其他表面设计技术，LBL以简单、多用途及纳米结构调控的优势引起广泛关注。Wang等[47]采用基于LBL技术的从头合成策略，制备出一种仿生骨膜。骨修复和重建实验显示该仿生骨膜重现了骨膜骨修复的全过程，为进一步研制多组分和多功能人工骨膜提供了技术平台。Gentile等[48]利用LBL装配技术分别将增强细胞黏附和增殖、指导干细胞分化和提高矿物质基质形成的肽片段融合到支架材料中，诱导产生良好的体内应答。

4.3模块装配技术 模块装配技术通过模拟复杂组织的显微结构特征，为制备更大和更多的复杂组织构建物提供可行的途径。一般先制备不同生物材料组分、细胞类型和(或)生物活性因子的亚单元，然后组装成能模拟天然组织空间变化的多元工程复合体，其显著优点是能制备结构更加复杂的生物材料。不同模块发挥各自的功能，通过加入促血管生成亚单元可以改进工程构建物的血管生成，常被用于提高组织工程构建物的血管化，包括血管化骨[49-50]。目前该策略还只作为了解和检查细胞应答的体外研究工具。临床转化中仍需大量体内动物实验研究确定如何保持提高信号可控性与装配复杂程度之间的平衡，达到降低复杂装配步骤导致较高治疗成本的目的。

5 小 结

生物材料作为成骨细胞生长和血管系统建立的模板，其类型选择和功能修饰是骨组织工程技术中的关键环节。近年来，骨组织工程血管化研究方面已取得长足进步，但是由于骨组织工程的特殊性和复杂性，距离完全替代天然骨的目标仍任重道远。随着细胞生物学、材料学和生物医学工程的发展，联合多学科技术优势共同攻克骨组织工程血管化难题将是未来的发展趋势。