EAG2在恶性肿瘤中的研究进展

李 敏，闫金玉，唐云飞，王 静，杜东书，陈付学※

(1.上海大学生命科学学院脑与心脏分子生物学实验室，上海 200444；2.山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，济南 205101)

离子通道是成孔的跨膜蛋白，通过控制跨膜离子流调节生物体的生命活动，不仅参与细胞骨架的重塑和细胞之间的相互作用，还可调节细胞迁移和侵袭性生长等过程[1]。K+通道在调节神经元兴奋性过程中具有重要作用[2]。人类基因组编码40个电压门控K+通道，参与多种生理过程，如参与神经元和心脏动作电位的复极化、调节Ca2+信号和细胞体积、推动细胞增殖和迁移，电压门控K+通道是自身免疫疾病、神经和心血管疾病及恶性肿瘤治疗药物的开发研究热点[3]。电压门控K+通道的Ether-a-go-go(EAG)超家族由Eag、Elk、Erg 三个功能不同的基因家族组成，编码各种低阈值K+电流，可在无脊椎动物和哺乳动物等生物体中的可兴奋细胞广泛表达[4-5]。激活EAG2电压门控K+通道，可使K+流出细胞，从而调节生命活动。EAG通道及各亚型通常通过突变作用于神经元，引起神经系统疾病，对维持正常生命活动具有重要作用。

恶性肿瘤的病死率极高。据统计，2010年美国确诊恶性肿瘤患者1 529 560例，其中569 490例死亡[1]。离子通道参与恶性肿瘤的发生，肿瘤细胞可在低氧条件下无限增殖、迁移和存活。在细胞癌变过程中，某些恶性细胞Ca2+信号发生重塑，并通过抑制正常细胞增殖、逃避程序化细胞死亡、适应缺氧环境、侵袭和扩散到原发肿瘤部位，从而破坏正常生理功能[6]。离子转运蛋白和水通道蛋白可通过诱导细胞体积变化和调节Ca2+和H+信号促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[7]。在恶性肿瘤中，EAG电压门控K+通道的异常表达可改变细胞周期的下游信号[8]。EAG通道可在多种器官肿瘤中表达，并与肿瘤细胞的细胞周期进程和增殖密切相关。Asher等[9]研究发现，EAG电压门控K+通道调节剂是肿瘤发展的抑制剂，通过抑制EAG通道的表达可减少体外和体内的肿瘤增殖。正常组织中，EAG通道呈限制性表达，故可能成为新的肿瘤标志物。现对EAG2在恶性肿瘤中的研究进展予以综述。

1 EAG2的结构、生理特性和分布表达

1.1EAG2的结构及电生理特征 EAG家族的结构与其他电压门控K+通道相同，由4个亚基以及位于胞内的C端和N端组成，每个亚基由6个跨膜段(S1～S6)组成[10]。S1～S4是相对独立的电压传感域，可将膜电位变化转化为通道门控。K+选择性透过孔位于S5～S6，门控电压主要由S4结构域内两个疏水残基隔开的阳性精氨酸或赖氨酸残基链作为电压传感器感测[11-12]。EAG2的N端保守结构域由带有端盖结构PAS结构域组成，C端包含1个环核苷酸结合的同源结构域。EAG2属于EAG家族成员之一，与已知哺乳动物同源基因EAG1非常相似，故被称为EAG2[13]。

EAG2和EAG1的氨基酸序列有70%的同源性[12]。相关研究表明，EAG2与EAG家族其他蛋白质的整体结构相同，均具有6个跨膜结构域，此外，EAG2还含有存在于S5～S6的特征孔(H5区域)，且不同EAG电压门控K+通道成孔亚基中的特征孔(H5区域)高度保守，有助于形成通道K+选择性透过孔[14]。EAG2通道的闭合通过钙调素与通道 N端和C端的3个离散位点钙调素依赖的结合实现，与电压传感器的激活无关[10]。

电压门控EAG2通道含有环状核苷酸结合同源结构域和多种钙调蛋白结合基序。细胞内Ca2+浓度升高可引起EAG2通道C端胞质部分异源表达和原生EAG2通道的蛋白水解消化。Shimizu等[15]采用Ca2+载体A23187处理表达EAG2的细胞1 h发现，EAG2通道全长蛋白质减少约80%，并伴有分子量30 000～35 000肽的出现；用Ca2+-ATP酶抑制剂毒胡萝卜素处理3 h可去除EAG2通道蛋白质中约1/3的分子量为30 000～35 000的肽。由于细胞内Ca2+浓度增加可导致EAG2通道蛋白水解，故Ca2+诱导的EAG2通道蛋白水解切割是EAG2通道蛋白的正常生理或病理反应。

EAG2通道对生理pH变化的敏感性较高，EAG2易受细胞膜外质子的抑制。细胞膜外的酸性环境可使EAG2通道的电导电压曲线向去极化方向移动，导致电压阈值下限降低，由此可见，EAG2通道对细胞膜外生理pH的变化高度敏感。EAG2通道的高pH敏感性有助于观察体内pH敏感的K+电流[4]。EAG2对细胞外Mg2+水平的变化敏感，当细胞外Mg2+水平升高时，EAG2电导电压的激活曲线降低[16]。当细胞外无Mg2+时，EAG2对细胞外pH的变化更敏感。

Schönherr等[17]对比克隆人EAG(human EAG，hEAG)2与同工型hEAG1的研究发现，在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中，hEAG2激活的时间较hEAG1慢；对于hEAG2通道，亚基半最大激活所需电压约为10 mV，但hEAG2激活对电压的依赖性较小，电压敏感性较低，故hEAG2通道可在较hEAG1电压更低的电压条件下开放。对hEAG2和hEAG1共表达及其产生电流的动力学分析表明，hEAG2和hEAG1可形成异源通道复合物。

1.2EAG2的分布表达 Kcnh5编码的EAG2(Kv10.2)蛋白主要在丘脑表达，在脑、睾丸、骨骼肌、心脏、胎盘、肺、肝脏亦有表达，在肾脏和胰腺的表达水平较低[18]。SD大鼠EAG2信使RNA主要在神经组织中表达，在成人骨骼、心脏和平滑肌中未检测到其表达。EAG2在脑中的分布与大鼠皮质和嗅球内EAG1的分布区域重叠，但其他部位的EAG2分布与EAG1存在差异，EAG2在小脑很少表达，但可在除纹状体和脑垂体以外的大多数神经组织表达，最主要的表达部位是丘脑、下丘脑和某些脑干核[19]。大鼠EAG2信使RNA在小脑、海马、皮质和髓质少量表达，脾、肝、肺、肾、心脏、主动脉未检测到其表达。

Jow和Jeng[20]通过免疫荧光细胞化学染色联合激光扫描共聚焦显微技术对视网膜EAG2表达的研究显示，大鼠视网膜EAG1(rEAG1)和EAG2(rEAG2)的表达模式不同，视网膜内丛状层外半部分rEAG1免疫反应最突出，而感光细胞、外丛状层和内核层外部和内部段rEAG2的免疫反应较强。由此可见，rEAG1和rEAG2 通道可能在视网膜神经元电路的电信号传输中起重要作用。

Chuang等[21]对培养的幼龄海马神经元和成熟海马神经元的免疫荧光分析表明，树突状细胞和轴突区室中存在内源性rEAG1和rEAG2电压门控K+通道。海马神经元和视网膜树突体细胞间的大鼠EAG1和EAG2通道的亚细胞定位不同[20]。rEAG1通道呈现点状模式表达，与rEAG1相比，rEAG2 可能仅表达于培养7 d和12 d的体外神经元轴突中，且表达水平较低，此外，rEAG2在几乎所有神经元树突状细胞或轴突均未显示明显的点状分布[21]。

2 EAG2与恶性肿瘤

EAG2电压门控K+通道主要在神经系统中表达，目前对EAG2电压门控K+通道功能的研究较少。Yang等[22]的多态结构模型研究发现，癫痫性脑病和具有自闭症特征患儿的EAG2功能发生了获得性突变。目前，尚无神经系统与EAG2电压门控K+通道功能实例的相关报道，EAG电压门控K+通道突变导致神经系统性能受损不仅与EAG通道功能障碍有关，还可能与脑发育期间EAG通道的特殊作用有关。EAG2电压门控K+通道可持续影响神经元网络系统，其在神经系统疾病中的作用不容忽视。与EAG2可在神经系统疾病中发挥作用相似，EAG2电压门控K+通道可能对肿瘤细胞的增殖起重要作用。

肿瘤的发生过程与遗传物质的改变相关，遗传物质的改变可能导致正常细胞转化为肿瘤细胞。细胞恶化可引起多种信号分子异常，导致肿瘤细胞获得许多特定能力，如增殖不受控制、抵抗细胞凋亡。据报道电压门控K+通道在肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭中发挥不同的作用[23]。此外，肿瘤细胞中的电压门控K+通道可通过调节免疫反应促进恶性肿瘤的发生发展[24]。EAG2电压门控K+通道具有致癌性，不仅可参与肿瘤的发生和发展，还可抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖[25]。离子通道阻滞剂在体外通常可抑制恶性肿瘤细胞生长，如非特异性EAG电压门控K+通道阻滞剂可诱导细胞膜去极化，从而影响黑色素瘤细胞系的增殖[26]。此外，细胞外K+浓度升高引起的膜去极化也以类似的方式抑制循环细胞的增殖[27]。现对肾细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌与髓母细胞瘤中EAG2的异常表达予以阐述。

2.1EAG2与肾细胞癌 肾细胞癌是最常见的肾癌类型，占肾癌的90%～95%[28]。目前，全球肾癌的发病率每年增加约2%，男性与女性的发病比例约为1.5∶1，以60～70岁人群的发病率最高[29]。EAG1在大脑中广泛表达，但在肝、肺、心脏和肾脏较少表达[30]。正常组织中EAG1的分布很少，恶性肿瘤细胞中EAG1的表达上调。已有研究证实，EAG1在多种肿瘤细胞系中表达，其中包括肾细胞癌[31]。

与EAG1相同，EAG2也主要存在于神经系统。EAG2电压门控K+通道在肾细胞癌中也呈过表达，Wadhwa等[24]比较肾细胞癌和正常肾组织中EAG和hEAG通道的研究发现，正常肾组织缺乏EAG2表达，而肾细胞癌中EAG2的表达明显升高。可见，EAG2是肾细胞癌的潜在诊断指标和治疗靶点。

2.2EAG2与黑色素瘤 黑色素瘤是从含有黑色素的细胞中发展而来的癌症，又称恶性黑色素瘤。对黑色素瘤细胞功能特性的研究是制定抗肿瘤策略的重要前提。常利用电生理学和分子生物学方法表征人黑色素瘤细胞系的电压门控K+通道，Meyer等[27]发现，所有黑素瘤细胞系均表达外向整流电压门控K+通道，表明黑色素瘤中存在EAG1的表达，可见EAG电压门控K+通道在黑色素瘤细胞增殖中发挥重要功能[32]。黑色素瘤细胞系的增殖可能受非特异性电压门控K+通道阻滞剂(细格孢氮杂酸、奎尼丁)的影响[33]。

EAG2通道可在恶性肿瘤细胞系(包括黑色素瘤)以及正常成人脑和胎盘中表达。由于恶性肿瘤中EAG2电压门控K+通道的表达存在异常，且转录活跃的基因通常与启动子低甲基化和非活性启动子的DNA过甲基化有关，故可对EAG2电压门控K+通道基因启动子的DNA甲基化状态进行研究。Kcnh5 参与肿瘤的细胞周期调控及增殖，其甲基化状态异常可能是黑色素瘤发生的标志[23]。Macaulay 等[34]研究发现，EAG2电压门控K+通道的逆转录转座子基因Kcnh5的甲基化程度较低，仅在人胎盘中表达。但可在黑色素瘤中检测出来自胎盘特异性转录本的RNA[35]。因此，胎盘特异性Kcnh5 启动子的低甲基化通常与黑素瘤细胞中Kcnh5 表达相关。

2.3EAG2与胰腺癌 胰腺细胞繁殖失控并形成肿块，导致胰腺癌的发生。电压门控K+通道对调节胰腺内分泌和外分泌功能十分重要。在内分泌胰腺中，许多电压门控K+通道在胰岛细胞中表达，并参与胰岛素分泌；在外分泌胰腺中，腺泡细胞中电压门控K+通道的主要作用是调节电解质和酶的分泌。电压门控K+通道可以决定细胞的静息膜电位，并为胰腺和唾液腺等上皮细胞的离子转运和液体分泌提供动力[36]。电压门控K+通道可调节细胞兴奋性，参与上皮细胞的增殖、凋亡及离子转运，并对胰腺癌具有靶向治疗作用(使用电压门控K+通道开放剂以维持或上调胰腺分泌)。胰管中电压门控K+通道可使膜电位超极化，并为阴离子分泌提供驱动力。胰管细胞功能性电压门控K+通道的分子候选物包括Kcnn4 (KCa3.1)、Kcnma1 (KCa1.1)、Kcnq1 (Kv7.1)、Kcnh2 (Kv11.1)、Kcnh5 (Kv10.2)、Kcnt1 (KCa4.1)、Kcnt2 (KCa4.2)和Kcnk5 (K2P5.1)[12]。Kcnh5在啮齿动物和人胰管细胞中清晰表达，但EAG2通道的生理或潜在病理生理作用尚不清楚。一些EAG2电压门控K+通道被认为是恶性肿瘤的标志物，将特定电压门控K+通道开放剂或抑制剂用于治疗胰腺疾病仍需更深入的研究。

2.4EAG2与髓母细胞瘤 髓母细胞瘤是儿童中枢神经系统最常见的恶性脑肿瘤，常沿脑和脊髓的软脑膜转移[37]。Huang和Jan[38]通过全基因组微阵列研究发现，不同分子和组织学亚群中EAG2的过表达是髓母细胞瘤的特征之一。对髓母细胞瘤的分子学和电生理学研究证实，髓母细胞瘤细胞中存在过量的EAG2蛋白，且EAG2过表达是人类髓母细胞瘤的重要特征[39]。EAG2表达水平下降不仅损害体外髓母细胞瘤细胞的生长，还可降低体内肿瘤负荷，并可提高其在异种移植研究中的存活率，表明EAG2电压门控K+通道在促进脑肿瘤生长和转移中具有进化保守功能，进一步说明靶向EAG2电压门控K+通道在恶性肿瘤治疗中的潜力[40]。下调EAG2表达可抑制髓母细胞瘤细胞的有丝分裂，增强p38促分裂原活化的蛋白激酶信号通路的活性，抑制肿瘤生长。与此相反，异位膜EAG2可导致髓母细胞瘤细胞体积减小、细胞间期分裂样形态细胞明显减少，伴细胞周期异常，并可出现细胞凋亡，影响细胞生长。由此可见，EAG2可能是重要的髓母细胞瘤治疗药物开发靶点。

3 小 结

EAG1和EAG2是EAG通道家族成员，在恶性肿瘤中呈过表达，可作为恶性肿瘤的标志物和治疗靶点。EAG2电压门控K+通道主要在神经系统表达。目前，对肿瘤中EAG2作用机制的相关研究较少。EAG2可在人类神经系统疾病以及恶性肿瘤中发挥重要作用，特别对恶性肿瘤的研究具有重要作用，但具体机制尚不清楚。探索EAG2与人类神经系统疾病及恶性肿瘤发生发展的关系有助于加深对恶性肿瘤发病机制及诊断方法的认识，为开发有效治疗恶性肿瘤的药物及方法提供理论支持。