TLR4及其信号通路参与肾纤维化机制研究进展

杨 霜综述，王 丽，樊均明审校

0 引 言

慢性肾病是世界上发病率及病死率极高的疾病类型之一，据估计，其全球发病率为8%～16%，成为影响公众健康的重大疾病。慢性肾病的共同病理特点是肾间质纤维化。当肾受到损伤刺激时，肾固有细胞（肾小管上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞）及浸润到肾的巨噬细胞被激活，肌成纤维细胞增生，分泌大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM），取代肾原有结构，形成纤维化。而肾间质纤维化发生机制复杂，炎症、氧化应激、凋亡等机制均参与肾间质纤维化的形成。研究表明，慢性持续性炎症是慢性肾病进展的重要机制。虽然内外肾损伤因素引起的炎症应答是机体一种保护性机制，但持续存在的炎症会成为有害因素促进肾间质纤维化的形成。Toll样受体 4（Toll⁃like receptors，TLR4）信号通路在炎症应答中发挥重要作用，肾受到损伤刺激时激活该通路，引起大量炎症因子、趋化因子分泌、巨噬细胞表型转化及氧化应激，促进肾纤维化发生发展，本文主要从TLR4及其下游通路在肾纤维化中的作用作一综述。

1 TLR4信号通路参与肾纤维化的机制

1.1 TLR4信号通路活化TLRs是细胞膜表面模式识别受体，属于固有免疫系统。目前，对于不同TLRs家族成员在肾损伤中的作用研究众多，如TLR2、TLR4、TLR9激活均可导致肾损伤。其中，TLR4研究最深，既往研究认为TLR4只表达于单核巨噬细胞，但越来越多研究表明，TLR4的表达具有多样化，可表达于多种细胞类型，如肾小管上皮细胞、内皮细胞等［1⁃2］。

近年来，大量研究发现在不同病因引起急慢性肾损伤中均观察到TLR4及其信号通路的活化。如在糖尿病肾病中，高糖刺激上调肾固有细胞如肾小管上皮细胞、内皮细胞、足细胞胞膜TLR4表达，导致炎症因子、趋化因子、活性氧（reactive oxygen spe⁃cies，ROS）分泌，进一步加重炎症及巨噬细胞浸润，介导肾损伤及纤维化形成［3］。在高尿酸引起肾病中，尿酸刺激激活肾小管上皮细胞TLR4/NF⁃κB通路，释放炎症因子诱导肾小管上皮细胞发生上皮间充质转分化，导致细胞外基质分泌增多，纤维化形成［4］。Sathunr等［5］研究表明，在高血压肾损害模型中，敲除TLR4小鼠与未敲除组小鼠相比，收缩压、舒张压及平均动脉压降低，M1型巨噬细胞浸润减轻，细胞外基质减少，肾损伤减轻，表明TLR4在高血压肾损害中发挥重要作用。而在不同病因所致急性肾损伤中，如顺铂肾损伤、脂多糖（lipopolysac⁃charide，LPS）诱导急性肾损伤及环孢素肾毒性中均观察到TLR4/NF⁃κB通路表达上调，而给予干预措施抑制TLR4，NF⁃κB通路表达，肾损伤减轻［6⁃8］。同时，在各种类型肾小球肾炎中，也观察到TLR4/NF⁃κB信号通路的活化。一项临床研究数据显示，在系统性红斑狼疮患者血清中检测到TLR4可作为评估疾病活动及狼疮性肾炎进展的指标［9］。

而TLR4信号通路活化主要机制为：肾受到损伤刺激，肾实质细胞及骨髓来源或局部定居型巨噬细胞表面TLR4与病原相关分子模式或损伤相关分子 模 式（damage associated molecular patterns，DAMPs）结合形成复合体而被激活，主要通过依赖Myd88途径信号转导，激活下游NF⁃κB通路，介导促炎因子基因转录，炎症介质表达，促进肾纤维化。如高 迁 移 率 族 蛋 白 1（high mobility group box⁃1，HMGB1）为肾固有细胞释放的内源性损伤分子，属于DAMPs，在糖尿病肾病、5/6肾切除、单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）等肾损伤模型中，均发现HMGB1分泌增多，与TLR4结合而激活TLR4/NF⁃κB通路，促进肾炎症及纤维化［10］。有研究表明，缺血后急性肾损伤模型中，坏死的肾小管上皮细胞释放组蛋白，作为DAMPs，与TLR4结合促进炎症因子表达介导肾损伤［11］。

1.2 TLR4信号通路激活介导肾纤维化机制TLR4活化，激活下游NF⁃κB信号通路介导大量炎症因子（TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β等）、趋化因子如单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemotactic protein⁃1 MCP⁃1）分泌是导致肾纤维化重要机制。促炎因子及趋化因子促进肾纤维化机制为高表达的IL⁃1β是促进肾纤维化的关键因子。IL⁃1β可激活TGFβ/Smad2/3信号通路，高表达TGF⁃β与系膜细胞、上皮细胞、肌成纤维细胞表面受体结合，促进ECM合成。另外，有研究表明IL⁃1β调节通路Pi3k/Akt信号通路的活化，促进纤维化［12］。TNF⁃α也是促纤维化的重要炎症因子，巨噬细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞分泌的TNF⁃α可上调MCP⁃1表达，特异性趋化巨噬细胞浸润到受损肾组织，导致炎症因子持续活化及蛋白酶破坏基底膜，增加TGF⁃β1、ROS等促纤维化因素的产生，细胞外基质分泌增多。另一方面，TNF⁃α与系膜细胞表面受体结合，系膜细胞分泌IL⁃6，促进系膜细胞增殖及细胞外基质合成［13］。此外，有研究表明，TLR4不仅介导炎症，还可介导氧化应激。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinu⁃cleotide phosphate，NADPH）是体内产生活性氧的主要来源，其亚型NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，Nox4）在肾中高表达，在LPS刺激应答中，TLR4可直接与Nox4结合促进ROS产生［14］。

巨噬细胞极化在肾损伤应答及纤维化中发挥重要作用。巨噬细胞分为经典激活的M1型及选择性激活的M2型，M1型巨噬细胞活化，导致促炎因子如TNF⁃α、IL⁃1β等的表达，促进纤维化；相反，M2型巨噬细胞分泌抗炎细胞因子如IL⁃4、IL⁃10，减轻炎症反应，增加吞噬活性，修复损伤。巨噬细胞极化在肾纤维化中发挥重要作用，研究表明，UUO早期阶段，浸润到肾的巨噬细胞主要极化为M1型，分泌促炎因子，促进纤维化的形成［15］。而抑制M1型巨噬细胞，促进M1型转化为M2型可减轻肾炎症及肾纤维化。TLR4及其信号通路与巨噬细胞极化密切相关。Orr等［16］应用高脂饮食动物模型研究发现，TLR4激活促进脂肪组织巨噬细胞极化为M1型，而TLR4缺乏可促进巨噬细胞极化为M2型，减轻脂肪组织炎症。有研究表明，在UUO模型肾损伤早期，损伤的肾小管上皮及浸润于肾间质的巨噬细胞释放HMGB1，HMGB1诱导M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶表达增多，M2型巨噬细胞标志物IL⁃10表达减少，即HMGB1促进巨噬细胞极化为M1型，炎症因子表达增多，肾损伤及纤维化加重。而给予HMGB1特异性抑制剂抑制HMGB1表达，UUO损伤早期M2型巨噬细胞表达增多，肾损伤及肾纤维化减轻［17］。而 HMGB1 为 TLR4 上游分子，故HMGB1及其下游TLR4信号通路在巨噬细胞极化中发挥重要作用。Zhou等［18］研究表明，姜黄素可通过抑制TLR4/NF⁃κB通路促进巨噬细胞极化为M2型，减轻炎症，减轻动脉粥样硬化，而利用SiTLR4干扰TLR4，NF⁃κB通路受抑，巨噬细胞极化为M2型。进一步证明TLR4及其信号通路调控巨噬细胞表型转化。

TLR4/NF⁃κB通路调节巨噬细胞极化，促进肾纤维化，但其调控巨噬细胞极化机制尚不清楚，最近有研究表明，Mincle/Syk通路在维持M1型巨噬细胞表型中发挥重要作用。Mincle为固有免疫系统中跨膜模式识别受体，主要表达于M1型巨噬细胞。Lan等［19］通过NF⁃κB/P65与LPS诱导巨噬细胞中Mincle启动子区域结合证明TLR4/NF⁃κB信号调控Mincle的表达，重要的是，研究发现，Mincle通过Syk传导途径促进和维持M1型巨噬细胞表型，敲除Mincle或抑制Syk可抑制LPS诱导M1型巨噬细胞炎症介质IL⁃1β、MCP⁃1等表达。

2 TLR4信号通路的上游调控机制

TLR4通过信号传导调控下游转录因子NF⁃κB活性调节炎症应答，而TLR4信号通路上游受多种基因、蛋白质的调控。CHOP蛋白是由内质网应激诱导表达，主要功能是调节细胞的程序性死亡（凋亡）。研究发现，UUO模型中敲除小鼠CHOP基因后抑制了肾小管上皮细胞凋亡被动释放及炎症细胞主动分泌HMGB1的表达，与细胞膜表面TLR4结合的HMGB1减少，下调TLR4/NF⁃κB信号通路激活，减轻UUO诱导的小鼠肾纤维化［20］。表明CHOP基因及相关蛋白表达，通过激活HMGB1/TLR4/NF⁃κB信号通路介导肾纤维化的发生发展。血管生成素样蛋白（angiopoietin like protein 2，ANGPTL2）是一种与血管生成素具有相似结构域的分泌性糖蛋白，已证明ANGPTL2通过调节炎症通路调节脂肪组织炎症应答。Yang等［21］研究表明，与对照组相比，糖尿病肾病大鼠TLR4及ANGPTL2均为高表达，而敲除ANGPTL2后的细胞及动物模型中，TLR4表达明显下降，炎症细胞因子及细胞外基质沉积明显减少，即ANGPTL2可调控TLR4活性，调控炎症反应及糖尿病肾病的进展。抗氧化相关因子红系衍生核因子相关因子2（nuclear factor erythroid 2⁃related fac⁃tor 2，Nrf2）是抗氧化应激主要转录因子，研究表明，UUO模型中炎症相关TLR4基因表达增强，而敲除Nrf2基因小鼠与模型组小鼠相比，TLR4基因表达下调，肾炎症纤维化减轻，表明Nrf2基因表达对TLR4信号通路具有调节作用［22］。TLR4/NF⁃κB通路上游调控机制有待更进一步研究。

3 以TLR4信号通路为靶点干预肾纤维化

已有大量研究表明，多种药物可作用于该通路，发挥机体保护作用。二甲双胍为临床一线降糖药物，研究表明，其可通过抑制TLR4/NF⁃kB通路，改善2型糖尿病大鼠模型骨骼肌胰岛素抵抗［23］。多项研究表明，下调或敲除TLR4可明显减轻肾纤维化。抗乙肝病毒药物替比夫定可通过抑制TLR4、NF⁃κB及下游炎症因子表达，减轻UUO模型纤维化［24］。中药在慢性肾病中的治疗作用受到越来越多的关注，黄芪甲苷是从黄芪中提取的高纯度药物，具有抗炎、抗应激等作用，研究表明，其可下调TLR4/NF⁃κB通路，使炎症因子分泌减少，延缓肾纤维化［25］。干细胞疗法为当前研究热点，Hu等［26］研究表明，人脐带源间充质干细胞条件培养液可下调TLR4/NF⁃κB信号通路，减少炎症因子TNF⁃α、IL⁃1β表达，抑制TGF⁃β1介导上皮间充质转分化，减轻肾纤维化。下调TLR4/NF⁃κB信号通路不仅能减轻炎症应答，延缓纤维化，对于顺铂、缺氧、LPS等引起的急性肾损伤，也有保护作用。绿原酸是一种多酚类化合物，广泛存在于药材中，具有很强的抗氧化抗炎作用，研究表明，在LPS诱导的急性肾损伤小鼠模型中，绿原酸可抑制TLR4的激活，NF⁃κB通路受抑制，减少炎症因子及趋化因子分泌，从而减轻肾损伤，为治疗急性肾损伤的新药物［27］。此外有研究表明中药成分葛根素、绿茶提取物茶多酚可下调TLR4/NF⁃κB通路，减轻顺铂肾损伤、缺血再灌注肾损伤。另一方面，下调TLR4/NFκB通路可调节巨噬细胞极化减轻纤维化。Chen等［28］体内体外研究均证实，松弛素通过下调TLR4/NF⁃κB信号通路改变巨噬细胞极化，使巨噬细胞在UUO早期极化抗炎的M2型，减少促炎因子分泌，炎症减轻，肾小管间质纤维化缓解。此外，NF⁃κB为抑制炎症及纤维化的另一重要作用靶点。Lefty⁃1基因具有调节转化生长因子及促分裂原活化蛋白激酶等作用，有研究表明其具有潜在抗炎活性。Zhang等［29］研究发现，腺病毒介导Lefty⁃1过表达可抑制NF⁃κB通路活性从而减轻UUO模型大鼠炎症及肾纤维化，体外研究进一步证实Lefty⁃1可抑制NF⁃κB通路减少LPS诱导肾小管上皮细胞炎症因子表达，具有临床应用前景。

4 结 语

在不同病因所致肾损伤中TLR4及其信号通路活化介导炎症、氧化应激参与肾纤维化发生发展，而下调TLR4/NF⁃κB通路可抑制巨噬细胞极化，减少炎症因子、趋化因子分泌，延缓慢性肾病的进展，目前已有多项研究均表明下调TLR4/NF⁃κB信号通路可减轻炎症而缓解纤维化。但TLR4信号通路介导固有免疫应答对机体应对应激具有保护作用，故TLR4及其信号通路的激活对肾有利及有害的关系有待进一步研究。巨噬细胞在肾纤维化中的作用为当前研究热点，TLR4/NF⁃κB通路调节巨噬细胞极化促进肾纤维化，但其具体调节机制尚未完全明确。且TLR4上游调节机制还需进一步探讨，以TLR4通路上游基因或蛋白质为靶点抗肾纤维化治疗有待进一步研究。