DNA甲基化修饰在恶性胸腔积液诊断中的研究进展

朱 叶，史家欣，李家树

(徐州医科大学附属连云港医院呼吸与危重症医学科，江苏 连云港222000)

恶性胸腔积液(malignant pleural effusion，MPE)是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液。确定MPE诊断的“金标准”是在胸腔积液细胞沉淀中找到恶性细胞[1]。几乎所有类型的肿瘤都可能发生胸膜受累，在所有的渗出性胸腔积液中MPE病死率居第二位，仅次于肺炎旁积液[2]。无论是代表真正的肿瘤侵犯还是疾病的间接影响(恶变性胸腔积液)，MPE均提示恶性肿瘤临床分期进入Ⅳ期，排除了治愈性治疗方法的可能[3]，因此一旦确诊，原发肿瘤部位的中位生存期为4～7个月，1年生存率为23%，2年生存率为7%，预后极差[4]。据调查，美国每天约有12.5万人因为MPE而住院，预估花费超过50亿美元[2]。随着肿瘤治疗手段的不断发展和人口的老龄化，预计MPE发病率会逐年增加，带来快速增长的医疗保健负担。虽然细胞学仍然是胸腔积液的主要诊断工具，但阳性率较差，特别是当肿瘤细胞不丰富时，可能会被胸腔积液中的反应性间皮细胞混淆[5]。因此，早期、准确诊断积液的性质，是一个关键的临床问题。随着MPE的形成机制被不断修订和完善，人们认为这可能依赖于特定且不同的转录程序[6]。现就DNA甲基化在MPE诊断中的研究进展予以综述。

1 DNA甲基化

20世纪80年代后期，在分子生物学空前发展的形势下，学科间的交叉会聚越来越明显，1975年，英国分子生物学家对表观遗传学进行了系统表述，即基因的核苷酸序列不变的前提下，研究导致基因表达出现差异的可遗传的调控方式[7-9]。对基因组而言，不仅仅是序列包含遗传信息，而且基因组的修饰也可以记载遗传信息[10]。主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA编辑、染色质重塑等。这些表观遗传修饰通过调节基因表达来确定每个细胞的身份，影响细胞因子的表达和转录因子的结合，进而影响免疫细胞(T细胞谱、B细胞等)的功能及免疫反应，维持机体内环境稳定[11-12]。近年研究发现，80%的疾病、肿瘤与表观遗传学相关，分析肿瘤标本或体液中单个基因的表观遗传变化和基因特征，对于肿瘤的分子亚分类、预后、对治疗的反应预测以及治疗后患者的随访都有帮助[9]。

DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的反应[13]。DNA甲基化主要发生在-C-磷酸-G-(CpG)位点。CpG位点中，胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)毗邻并以线性方式连接。哺乳动物60%～90%的CpG处于甲基化状态[14]，未甲基化的CpG通常成簇分布并形成CpG岛，CpG岛经常存在于许多基因的5′调控区，特别是启动子区。目前发现，肿瘤细胞基因启动子区域高含量的5-甲基胞嘧啶可造成基因转录沉默，继而抑制下游基因产物表达，导致细胞功能异常，从而使细胞癌变风险增加[15]。因此，CpG岛的甲基化修饰一直是研究的重点。

2 DNA甲基化与肿瘤

DNA甲基化是表观遗传学水平基因表达、细胞发育和细胞分化等过程调控的重要方式。异常的甲基化表现在癌症发生过程中有重要作用，可作为一种标记来区分癌细胞和非癌细胞[13]。2018年6月，美国临床肿瘤学会年会上宣布了关于肺癌早期诊断的最新成果，表明在98%的特异度标准下，甲基化差异能成功检出41%的早期肺癌(Ⅰ～ⅢA期)及89%的晚期肺癌(ⅢB～Ⅳ期)[16]。甲基化程度改变一般发生在肿瘤产生之前，随肿瘤的发展，该变化是可逆的。一项测定空气污染对肺癌影响的研究表明，大鼠肺组织中的特定基因在长期接受污染暴露后产生高甲基化，当机体适应污染后，甲基化的变化可以通过系统反应来调节，从而恢复正常水平[17]。另外，还有研究表明，DNA甲基化异常与肿瘤的复发、预后及评估组织间风险等方面也存在一定的联系[18-20]。同时，甲基化研究技术不断得到发展，特异位点甲基化研究技术主要包括甲基化特异聚合酶链反应、荧光定量法、亚硫酸氢盐处理后测序、高分辨率熔解曲线、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法、焦磷酸测序等[21]，这些技术的发展为研究者们提供了充分的技术支持，使肿瘤的诊断更为方便、快捷。更令人震惊的是，2016年，研究人员根据2790个起源已知的肿瘤样本(这些样本代表了38类肿瘤，包括85个转移病例)，建立了基于微阵列DNA甲基化标签的癌症分类方法，并将之称为微阵列DNA甲基化标记，成为首个用于诊断肿瘤起源的表观遗传学检测方法，使医师能够根据肿瘤类型来制订更具体的治疗方案[22]。基于上述研究背景，研究者们逐步探讨甲基化谱在鉴别恶性和良性胸腔积液中的诊断价值，检查血清和胸腔积液样本中甲基化的一致性[23]。

3 DNA甲基化在非小细胞肺癌相关的MPE中的诊断

MPE多继发于其他部位肿瘤的胸膜转移，临床上以肺癌为主，最常见的组织学类型为腺癌[24]。研究表明，在首次使用侵入性程序分析(胸腔穿刺、经皮肺穿刺活检、支气管镜活检等)的大约50%的疑似肺癌患者中诊断不能得到确认[25-27]。因此，为了避免重复穿刺或支气管镜检查，需要更有效的方法辅助确诊，针对胸腔积液的表观遗传研究对MPE的早期诊断尤其重要。

Wnt基因编码的Wnt分泌蛋白家族，通过与细胞表面不同的受体结合，与控制生长的丧失和细胞分化的损害有关，大多数细胞信号转导途径存在细胞外拮抗剂，作为对细胞生长分化的调控[28]。其中，拮抗剂重组人Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor 1，WIF-1)能够与Wnt蛋白结合并抑制Wnt蛋白的活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖分化[29]。在75%～83%的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中发现，WIF-1启动子区域呈高甲基化状态，下调WIF-1而异常激活Wnt通路[30]。后来人们发现，WIF-1中存在5个表皮生长因子样域[31]。既往大量研究证实，表皮生长因子受体信号转导可促进肿瘤血管生成与血管渗漏[32]。由此推断，WIF-1对MPE的形成具有一定意义。Yang等[33]运用甲基化特异聚合酶链反应技术对WIF-1启动子甲基化异常用于诊断NSCLC相关MPE的诊断价值做出了分析，灵敏度为69.4%，特异度为100%，提示WIF-1启动子区域在胸腔积液细胞中的高甲基化可以作为NSCLC相关MPE的辅助诊断标志物。

抑癌基因p16是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂。p16基因编码产物是分子量为16 000的蛋白，即p16蛋白，定位于细胞核内，p16蛋白是作用于细胞分裂周期关键酶之一的周期蛋白依赖性激酶4的抑制因子，p16基因的表达一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤的发生[34]，因此常将p16基因比作细胞周期中的刹车装置[35]。曾有研究表明，在Ⅰ/Ⅱ期肺癌患者中，p16甲基化与整体生存率密切相关[36]。刘大鹰等[37]证实了在肺腺癌相关的MPE中p16基因甲基化的诊断价值，灵敏度为69.4%，特异度为86.7%，准确率为77.3%，并表明p16基因的甲基化状态与肿瘤的组织细胞类型及分化程度无关，进一步表明了p16基因甲基化是肺癌发生发展中的早期事件。由于病例数量有限，刘大鹰等[37]的结果存在一定的争议。2013年一项荟萃分析证实，在胸腔积液中，p16甲基化检测在MPE的诊断中发挥着重要作用，灵敏度41%，特异度97%[38]。

人矮小同源盒基因SHOX2(short stature homobox 2)是同源盒基因家族的一员，位于X染色体短臂22.33(Xp22.33)和Y染色体短臂11.3位置(Yp11.3)，因最初被发现与一系列生长发育迟缓和身材矮小的疾病有关而得名，主要作用是编码蛋白转录因子[39]。研究表明，SHOX2基因表达调控对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要作用[40]。SHOX2基因有2个较大的CpG岛，1个在基因的5′端覆盖约1 kb的区域，另1个在3′端覆盖约0.5 kb的区域[41]。以肺癌组织或细胞为对象的甲基化研究均发现SHOX2基因CpG岛的甲基化水平比正常组织或细胞显著升高，即超甲基化现象[42-45]。推测由于SHOX2基因编码蛋白转录因子，其基因的超甲基化对下游基因产物表达有很大影响，所以SHOX2基因超甲基化有可能影响多个蛋白的表达，从而促使细胞癌变。Ilse等[46]在胸腔积液标本中发现SHOX2基因的高甲基化是诊断MPE的高度特异性生物标志物(特异度96.2%，灵敏度39.5%)，结果提示更侧重于MPE的确诊，而非筛选。栗少飞和聂立功[47]在60例胸腔积液中进行研究，得出的结论与Ilse等[46]的结果(灵敏度35.7%，特异度100%)一致。一项荟萃分析表明，在NSCLC相关的MPE中，SHOX2甲基化较传统的生物标志物(癌胚抗原、细胞角蛋白19片段抗原21-1、鳞状细胞癌抗原和神经元特异性烯醇化酶等[48])，具有更高的灵敏度(70%)和特异度(96%)[42]。

O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一种DNA修复蛋白，MGMT通过启动子甲基化沉默，导致MGMT蛋白低表达，可降低DNA修复活性[49]。此前，MGMT启动子甲基化被证实与肺癌p53基因G:C向A:T转化突变有关，在非吸烟者肺腺癌中比在吸烟者中更常见，并与肿瘤进展有关(晚期较早期更普遍)[50]。由此推测，MGMT甲基化检测可能是一种有前途的非/微创检测方法，在肿瘤组织难以获取患者的临床治疗中具有特殊的应用价值。Katayama等[51]试验发现，在81例胸腔积液患者(恶性47例、非恶性37例)中，MGMT甲基化未出现在非MPE中，推测MGMT基因甲基化可能是区别良恶性胸腔积液的生物学标志物。但由于样本量较少，仍需大量实验论证。

基于单基因的研究发现，单个表观遗传标志物诊断MPE具有极高的特异性，但灵敏度似乎不够理想[51]。因此猜测，一种以上基因同时甲基化的频率可能为检测提供一种更为敏感的方法。Botana-Rial等[52]使用甲基化特异聚合酶链反应技术检测胸腔积液中肿瘤抑制基因p16、MGMT、乳腺癌1号基因和视黄醇受体β的甲基化水平，使用受试者操作特征曲线评估用于区分恶性和良性胸腔积液的各基因的准确性；采用单变量和多变量Logistic回归分析，检测各基因甲基化水平与MPE之间的关系，结果在83.3%的MPE患者中检测到至少一种基因的高甲基化。一项关于不同类型肿瘤导致的MPE中8种基因甲基化(视黄醇受体β、腺瘤样结肠息肉易感基因、乳腺癌1号基因、MGMT、视黄醇结合蛋白1、脆性组氨酸三联体、Ras相关区域家族1基因、p16)的前瞻性队列研究表明，单独细胞学诊断MPE的灵敏度为63%，单独甲基化的灵敏度为67%，两者的特异度均为100%，两者结合分析可将MPE的诊断灵敏度提高至88%，表明胸腔积液的甲基化检测可与细胞学产生互补作用，提高MPE的诊断率[53]。上述研究均提示胸腔积液中DNA的异常甲基化可能是MPE的一种有价值的诊断标志物。

4 DNA甲基化在恶性间皮瘤相关MPE中的诊断

恶性间皮瘤是与胸腔积液相关的最常见的原发性胸膜恶性肿瘤，患者中80%～95%在诊断时有大量胸腔积液[54]。但临床上间皮瘤较少见，因此常会发生漏诊。Fujii等[55]采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测了不同肺部疾病患者胸腔积液中特定DNA的甲基化状态，包括恶性间皮瘤、肺癌和良性的石棉胸膜炎，结果表明，胸腔积液DNA中肿瘤抑制基因 Ras相关区域家族1基因、p16、视黄醇受体β异常启动子高甲基化的鉴定可能是鉴别恶性间皮瘤与肺癌的一个有价值的标志物，在这3个基因中至少有1个基因甲基化的水平下，肺癌与恶性间皮瘤的区分灵敏度为67.4%，特异度和阳性预测值分别为79.5%和79.5%，证明了甲基化谱在胸腔积液DNA鉴别诊断恶性间皮瘤与肺癌的有效性。

5 小 结

DNA甲基化是转录和调控控制的重要表观遗传学改变，是表观基因组领域最有前途的生物标志物，它提供了一种强大的工具，可以根据直接从肿瘤或“偏远”位置(如痰、胸腔积液或血清)获得的遗传物质进行诊断，特别是当细胞数量有限时，可扩增的DNA标记可以为癌症检测和分类提供非常敏感的工具[56]。因此，胸腔积液DNA中异常的甲基化状态可能是MPE有价值的诊断标志物。然而，在临床实际工作中，甲基化检测技术仍有引物设计较难、试剂价格昂贵等问题，因此还未广泛推广于临床应用，多见于科研研究。但胸腔积液的甲基化分析是一种很有前途的、适合临床应用的工具，有必要进行进一步研究以寻找每种疾病特异性甲基化的基因或基因组合。