耐重金属苜蓿中华根瘤菌的筛选及其与能源植物联合富集铜的特性

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(农业部农业环境微生物重点实验室，南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095)

能源植物(energy plant)指那些利用光能效率高，具有合成较高还原性烃、可产生接近石油成分和替代石油使用产品的植物，以及富含油脂、糖类、淀粉类、纤维素等的植物[1-4]。柳枝稷(Panicumvirgatum)、芒(Miscanthussinensis)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、多年生黑麦草(Loliumperenne)和甜高粱(Sorghumbicolor)等富含木质纤维素和糖类的植物，因材料丰富，价格低廉，且不涉及粮食安全问题而成为当前能源植物的首选[5-7]。

由于中国农业可耕地严重不足，人多地少的国情决定了我国不可能用现有耕地、良田发展能源农业，在边际土地上发展能源植物是生物质能源最有前景的策略之一[8]。近年来研究者已尝试在荒山荒坡、盐碱地、尾矿区、排土场等边际土壤上种植能源植物。余海波等[9]利用能源植物进行的铜尾矿修复试验中荻(Triarrhenasacchariflora)和芦竹(Arundodonax)存活较多。Desjardins等[10]发现在重金属污染土壤中高羊茅(Festucaarundinacea)比苜蓿富集更多铜。Peralta-Videa等[11]发现紫花苜蓿可以吸收铜、镍、锌和镉。由此可见，受采矿业影响的土地普遍存在严重的水土流失和重金属污染等诸多生态环境问题，能源植物对重金属污染边际土壤的适应具有选择性。

为了提高能源植物的修复效率，研究者尝试通过添加土壤改良剂和植物促生微生物等措施，促进能源植物的生长和富集重金属[12]。杨何宝等[13]发现施肥和接种苜蓿根瘤菌可以促进苜蓿生长，但对铁尾矿砂理化性质的改善作用不显著。Poor等[14]发现在0.1 mmol·L-1CuCl2胁迫下，添加300 mmol·L-1EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)处理可以提高甜高粱茎干的光合作用、干重、糖含量和总铜积累量。Babu等[15]筛选到两株促生真菌PenicilliumaculeatumPDR-4和Trichodermasp. PDR-16，当用两株真菌接种甜高粱×苏丹草(Sorghumbicolor×sudanense)时，可以促进植物中砷、铜、铅和锌含量增加，而且土壤重金属有效态含量和有效P含量、植物生物量、叶绿素以及植物中砷、铅和锌含量也显著提高。Verdugo等[16]利用污泥、石灰和接种菌根真菌，提高了铜尾矿上黑麦草的生物量、叶绿素含量以及铜积累量。植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长和矿质营养吸收利用的有益菌类[17]，可避免菌根真菌的难以扩大培养、真菌潜在致病性等问题，目前作为重金属耐性植物适应环境胁迫如营养物质匮乏、干旱、重金属污染的有效策略，逐渐成为国内外重金属污染修复的研究热点[18-20]。但植物促生细菌能否与能源植物建立良好、安全的互惠关系，发挥根际效应提高修复效率，还需进一步探讨。

本研究通过筛选耐重金属的根瘤菌，利用根瘤菌促进紫花苜蓿和高生物量的多年生黑麦草、甜高粱等能源植物生长，以期建立耐重金属根瘤菌-能源植物联合修复的优良组合，促进矿区土壤理化性质的改善，为在矿区废弃地等边际土壤上可持续生产生物质能源、修复重金属污染土壤提供资源和有效途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤：采集自南京某铜矿废弃地(119°05′ N, 32°04′ E)土壤(0～20 cm表层土)。土壤有机质(8.5±0.3) g·kg-1，总Cu(1730.3±15.4) mg·kg-1，pH(6.7±0.1)。风干后过2 mm筛备用。

培养基：YMA固体培养基(甘露醇5.0 g，酵母粉1.0 g， K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，CaCO33.0 g，去离子水1000 mL，pH 7.0，琼脂粉18.0 g)，TY液体培养基(胰蛋白胨5.0 g，酵母粉3.0 g，无水CaCl20.6 g，H2O 1000 mL，pH 7.0)。

无氮营养液：MgSO4·7H2O 0.10 g，CaSO40.46 g，K2HPO40.14 g，KCl 0.75 g，柠檬酸铁0.075 g，H2BO32.86 mg，MnSO41.81 mg，ZnSO42.20 mg，CuSO4·5H2O 0.80 mg，H2MoO40.02 mg，去离子水1000 mL。

供试植物：紫花苜蓿(M.sativa)、多年生黑麦草(L.perenne)、甜高粱(S.bicolor)，购自江苏省南京市栖霞区春茵种子有限公司。

1.2 多金属耐性根瘤菌的分离筛选及鉴定

采集生长于南京市某铜矿废弃地土壤中的紫花苜蓿，用水冲洗干净。选取主根上饱满、直径大的粉红色根瘤，用无菌剪刀剪下，放入75%乙醇浸泡消毒2～3 min，用无菌水洗2～3次，再用3% NaClO溶液浸泡5 min，最后用无菌去离子水清洗5～7次。将表面消毒的根瘤放入含有0.3%刚果红、Cu2+浓度为100 mg·kg-1、Pb2+浓度500 mg·kg-1、Cd2+浓度为50 mg·kg-1的YMA固体平板中，用无菌镊子将根瘤夹破使汁液流出，然后进行涂布，28 ℃培养3～5 d。挑选表面湿润光滑、边缘整齐、呈现乳白色状的单菌落进行多次划线分离纯化。用革兰氏染色法染色，镜检。将纯度合格的根瘤菌进行斜面和甘油管保藏，备用。

提取供试菌株的总DNA，利用通用上下游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。PCR产物委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。测序结果用BLAST软件与GenBank中已知的16S rDNA序列进行比对分析。

参考李艳梅等[21]、东秀珠等[22]文献，进行根瘤菌部分生理生化特征测定，包括碳源利用、3-酮基乳糖反应、精氨酸脱羧酶等反应和柠檬酸盐利用等。产吲哚乙酸参考Gordon等[23]、Sheng等[24]的方法，铁载体能力测定参考Schwyn等[25]的方法。ACC脱氨酶测定参考Penrose等[26]的方法，固氮反应测定采用Schatz等[27]的方法。

根瘤菌回接试验采用无菌蛭石营养瓶进行种植。称取40 g蛭石装入罐头瓶中，按照蛭石∶无氮营养液=1∶2.5加入无氮营养液，用透气封口膜密封瓶口，121 ℃灭菌2 h。选取饱满、大小基本一致的紫花苜蓿种子，先后用75%乙醇、3%NaClO溶液表面消毒，无菌去离子水清洗。撒在灭菌的琼脂糖固体培养基(15 g·L-1)上，置于25 ℃避光发芽。将表面灭菌催芽的紫花苜蓿种子放入无菌蛭石营养瓶中，每瓶5颗，每瓶接种5 mL供试菌株菌悬液(108CFU·mL-1)，接等量无菌水处理作为对照，每个处理3个重复。待植株长出第1片真叶后，置于自然光照下进行培养，每隔4～5 d补充10 mL无氮营养液。种植50 d后收获植株，测定并记录紫花苜蓿株高、干重和根瘤数量。

1.3 盆栽试验

盆栽试验于2016年3-5月在南京农业大学牌楼实验基地温室中进行。将风干过筛土壤分装，每盆装土2.0 kg，种植前5 d浇水，以土壤充分吸水湿润为宜。将供试菌株单菌落接种至装有100 mL TY液体培养基的三角瓶中，28 ℃、200 r·min-1振荡培养18 h后，6000 r·min-1离心5 min，收集菌体沉淀。用无菌水重悬沉淀制备成OD600为0.8(约108CFU·mL-1)的菌悬液。将紫花苜蓿、黑麦草和甜高粱种子按照2.1的方法进行表面消毒，浸润在上述供试菌株菌悬液中4 h，对照组种子浸泡灭菌悬液(CK)。将处理好的种子播种于盆钵中，出苗后进行适当间苗，每盆留苗5株，再次分别接种20 mL供试菌株菌悬液和灭菌悬液，每组处理3个重复。生长过程中用去离子水浇灌，日常光照，温度一般在18～25 ℃。90 d 后分别收获植物地上部(茎叶)和根部，并取根际土壤风干待测。用去离子水冲洗3遍后于105 ℃下杀青，然后在75 ℃下烘干至恒重，测定干重，同时测定各植物样品中Cu的含量。

1.4 土壤和植物样品的分析方法

将植物样品磨碎，地上部和根部样品各称取0.50和0.05 g，加入10 mL混合酸(HNO3-HClO4体积比为3∶1)，采用微波消解仪进行微波消解预处理，用ICP-AES(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer)测定植物中Cu含量。

土壤有效态Cu含量测定参照Maiz等[28]的方法。将风干后的根际土壤样品过0.85 mm孔径筛，称取土壤样品 4.000 g于离心管中，加入20 mL提取剂(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA)，在25 ℃、200 r·min-1条件下振荡2 h。浸提后的样品在12000 r·min-1条件下离心10 min，过滤后用ICP-AES测定Cu含量。

在测定土壤和植物重金属含量的基础上，计算植物Cu富集系数和转移系数。Cu富集系数=地上部Cu含量/土壤Cu含量。Cu转移系数=地上部Cu含量/根部Cu含量。

参考鲍士旦《土壤农化分析》[29]中土壤酶活性测定，采用苯酚-次氯酸钠比色法测定脲酶活性，于波长578 nm处比色，单位(以NH4+-N计)为mg·(g·h)-1。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活性，于波长508 nm处比色，单位为mg·(g·h)-1。参考王学奎《植物生理生化实验原理和技术》[30]，使用苯酚法测定土壤中水溶性糖含量。

1.5 数据处理

利用Excel 2010进行数据处理，用GraphPad Prism 5软件作图，用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，差异显著性用配对样本T检验和单因素分析中LSD方法检验。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的筛选及鉴定

从紫花苜蓿根瘤中分离纯化得到1株具有较强耐受重金属Cu2+、Pb2+和Cd2+的菌株D10(表1)。该菌株能够利用葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和甘露醇为碳源，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阳性，利用柠檬酸盐，3-酮基乳糖反应阴性。16S rDNA序列与GenBank 中SinorhizobiummelilotiLMG6133(T)的16S rDNA 序列相似性达到100%。本研究中将其命名为S.melilotiD10，16S rDNA序列登录号为KX058129。

将菌株D10回接紫花苜蓿试验结果表明，菌株D10能与紫花苜蓿共生结瘤，促进苜蓿生长。由表2可知，与接灭菌液对照相比，接种D10的紫花苜蓿株高显著增加74.8%，根部和地上部干重分别显著增加1.5和1.6倍(P<0.05)。对照组紫花苜蓿没有检测到根瘤，接种D10的紫花苜蓿根瘤数量达到33个·pot-1。

表1 菌株D10的生物学特性和重金属耐性Table 1 Properties of metabolic property and heavy metals tolerance of strain D10

注：+表示阳性，-表示阴性。

Note: + indicate positive，- indicate negative.

表2 菌株D10对紫花苜蓿生长和结瘤的作用Table 2 Effect of strain D10 on the growth and nodulation of M. sativa

注：*表示T检验同一种植物中D10处理与CK有显著差异，P<0.05。下同。

Note: * indicates significant difference between D10 treatment and CK at 5% level by T test. The same below.

2.2 菌株D10促进植物生长的作用

由图1可知，在铜污染土壤生长的能源植物生物量差异表现为甜高粱>苜蓿>黑麦草，甜高粱的生物量可达到黑麦草的4.6～6.4倍，紫花苜蓿的生物量是黑麦草的1.2～2.4倍。菌株D10对供试植物的促生效果表现为苜蓿>甜高粱>黑麦草。与接灭菌液处理相比，接种D10的苜蓿根和地上部的干重分别显著增加78.1%和72.2%(P<0.05)，甜高粱根和地上部干重分别显著增加28.6%和39.3%(P<0.05)。D10对黑麦草几乎无促生作用。结果表明，在铜污染土壤中D10菌株仍能有效促进苜蓿生长，也与甜高粱匹配促进植物生长。

图1 铜污染土壤中菌株D10对能源植物生长的影响Fig.1 Effect of strain D10 on the biomass of the plants grown in the Cu-contaminated soil 不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)。下同。Different small letters are significant difference at P<0.05. The same below.

2.3 菌株D10促进植物吸收Cu的作用

由表3可知，3种植物Cu含量差异为甜高粱>黑麦草>紫花苜蓿，且植物根比地上部积累较多重金属Cu。接种菌株D10处理后，苜蓿和甜高粱根部Cu含量比接灭菌液对照分别显著增加18.4%和16.7%(P<0.05)。而菌株D10对3种植物的地上部Cu含量没有影响。

表3 菌株D10对能源植物吸收铜的影响Table 3 Effect of strain D10 on the Cu content and uptake of the plants

甜高粱Cu总吸收量远大于黑麦草和紫花苜蓿，由于甜高粱的地上部生物量远大于黑麦草和紫花苜蓿，地上部Cu总量低于根部Cu总量。接种菌株D10处理后，苜蓿和甜高粱Cu总吸收量也显著增加。与接灭菌液对照相比，D10处理的甜高粱根和地上部Cu吸收量分别显著增加50.4%和50.8%(P<0.05)，苜蓿根和地上部Cu吸收量分别显著增加111.8%和62.0%(P<0.05)，黑麦草根和地上部总吸收量变化不大。

甜高粱对Cu的转移系数和富集系数也高于苜蓿和黑麦草。接种D10处理后黑麦草Cu转移系数和富集系数没有差异。D10处理的苜蓿、甜高粱根Cu富集系数显著增加，但Cu转移系数几乎不变。结果表明，甜高粱比苜蓿和黑麦草富集较多的Cu，菌株D10能够促进甜高粱和紫花苜蓿富集较多Cu。

2.4 菌株D10对植物根际土壤有效态Cu含量、水溶性糖含量、蔗糖酶和脲酶活性的影响

植物根际土壤中重金属的生物有效性是制约植物提取效率的关键因素之一，而土壤中重金属的存在形态决定了重金属的生物利用率。由图2可知，与接灭菌液对照(CK)相比，接种D10后植物根际有效态Cu含量比对照均有所增加，其中甜高粱和黑麦草根际有效态Cu含量比对照分别显著增加29.0%和8.7%(P<0.05)，紫花苜蓿根际有效态Cu含量增加不显著。土壤中水溶性糖类是1种重要的碳水化合物，是微生物和植物最重要的营养物质之一。供试植物根际水溶性糖含量差异为甜高粱>黑麦草>紫花苜蓿，接种D10后，甜高粱根际水溶性糖含量比对照显著增加25.3%(P<0.05)，紫花苜蓿和黑麦草根际水溶性糖含量增加不显著。

图2 菌株D10对植物根际土壤有效态Cu含量、水溶性糖含量、蔗糖酶和脲酶活性的影响Fig.2 Effect of strain D10 on the contents of available Cu and water-dissolved carbohydrate, the activity of sucrase and urease in the rhizosphere soil of plants

指标Indexes(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)根Cu吸收量Cu uptake in root (1)10.994**0.587*0.907**0.971**0.952**-0.1760.899**-0.4170.475*地上部Cu吸收量Cu uptake in shoot (2)10.539*0.891**0.974**0.969**-0.1670.879**-0.4590.484*根Cu含量Cu content in root (3)10.811**0.4050.356-0.498*0.827**0.2740.002地上部Cu含量Cu content in shoot (4)10.820**0.772**-0.488*0.925**-0.2170.213根干重Root dry weight (5)10.984**-0.1070.801**-0.541*0.488*地上部干重Shoot dry weight (6)1-0.0210.784**-0.552*0.524*有效态Cu含量Available-Cu (7)1-0.276-0.0470.362水溶性糖含量Soluble sugar (8)1-0.1130.269蔗糖酶活性Sucrase activity (9)1-0.411脲酶活性Urease activity (10)1

注：*和**分别表示在 5%和1% 水平(双侧)上显著相关。

Note: * and ** indicate significant difference at 5% and 1% level, respectively.

重金属污染对土壤酶活性的影响多表现为抑制作用。接种D10后，黑麦草根际土壤中蔗糖酶活性比对照显著增加39.3%(P<0.05)，紫花苜蓿和甜高粱根际蔗糖酶活性增加不显著。接种D10处理的甜高粱根际土壤脲酶活性显著增加21.1%(P<0.05)，紫花苜蓿根际脲酶活性增加不显著，黑麦草根际脲酶活性反而有所下降。

由表4可知，植物根和地上部Cu吸收量与地上部Cu含量、干重和根际土壤水溶性糖含量极显著正相关，并且与根Cu含量、根际土壤脲酶活性显著正相关。植物根和地上部Cu含量与根际土壤中水溶性糖含量极显著正相关(P<0.01)，与有效态Cu含量显著负相关，而且植物地上部Cu含量与植物干重极显著正相关。植物根和地上部干重与根际土壤水溶性糖含量极显著正相关，与土壤脲酶活性显著正相关，与根际蔗糖酶活性显著负相关。植物根际有效态Cu含量与土壤酶活性和水溶性糖含量之间没有相关性。

3 讨论

3.1 耐重金属根瘤菌的筛选

多年生豆科牧草紫花苜蓿适应范围广、抗逆性强，作为生物能源的开发利用在国内外已经有不少研究[6]。如果有合适的根瘤菌与其共生结瘤固氮，可以大大减少紫花苜蓿的用肥量，降低其在边际土壤上的种植管理成本。因此，本研究从生长在重金属污染土壤上的紫花苜蓿根瘤中，分离筛选耐重金属的共生根瘤菌，有利于建立良好的共生固氮关系。研究结果表明筛选获得的S.melilotiD10菌株能够回接紫花苜蓿共生结瘤，在铜矿废弃地土壤上，S.melilotiD10菌株也能显著促进紫花苜蓿生长和富集铜。Fan等[31]从生长于中国西北某尾矿上的天蓝苜蓿根瘤中分离到耐Cu根瘤菌S.melilotiCCNWSX00200，Lu等[32]进行了在Cu或Zn胁迫下该菌株的转录组学分析，发现细菌铜抗性相关基因通过直接或间接方式影响根瘤形成，从而影响修复效率。根瘤菌与豆科植物品种间的不同共生组合，其固氮效果差异较大，这种差异由根瘤菌菌株和植物品种双方基因的相容性所决定，并涉及宿主植物、根瘤菌和环境间复杂的互作[33-34]。因此，S.melilotiD10菌株与紫花苜蓿的共生作用是否能够应用于其他土壤环境，还需要进行多品种、多地的应用研究，并阐明其互作机理。

3.2 不同能源植物对重金属的富集作用

紫花苜蓿、多年生黑麦草和甜高粱是当前能源植物的首选，在矿区废弃地上的种植也有应用，但不同植物在重金属污染土壤上的生长和富集重金属能力具有差异。冯鹏等[35]的研究结果表明多年生黑麦草根系生物量大，对轻度Pb、Cd污染土壤修复效果更为明显。De Gregori等[36]发现苜蓿可以积累较高浓度的Cu(19～126 mg·kg-1)和As(5.7～16.3 mg·kg-1)。Jia等[37]分析了96个基因型甜高粱对Cd的吸收作用，发现甜高粱的茎Cd含量范围为19.0～202.4 mg·kg-1，根中Cd含量277.0～898.3 mg·kg-1不等，而且甜高粱根生物量可以反映该植物对Cd的富集能力。本研究中在铜矿废弃地土壤上甜高粱生物量达到1.1 ～5.7 g·pot-1，对铜的富集量可达503.8～589.3 μg·pot-1，远大于紫花苜蓿和黑麦草。由此可知，大生物量植物甜高粱对重金属提取效果较好。

3.3 根瘤菌强化能源植物富集重金属的作用

根瘤菌作为特殊的植物促生细菌，能够与豆科植物共生、结瘤、固氮，还可以产生吲哚乙酸和铁载体等促生物质促进植物生长、提高植物对重金属的耐受性，而植物能够为附生的微生物提供生长所需的空间和养分[38-40]。在铜矿废弃地土壤上S.melilotiD10菌株能够显著促进紫花苜蓿生长，因为S.melilotiD10菌株与紫花苜蓿建立了良好的共生关系，结瘤固氮促进苜蓿生长。黑麦草和甜高粱都是禾本科草本植物，D10可以促进甜高粱的生长，但对黑麦草的促生作用不显著。菌株对其有促生作用，很可能是分泌植物激素等原因。此外，水溶性糖作为土壤有机质成分，是根际微生物和植物能够直接或快速利用的碳源和能源，也是根系分泌物的一种，可以影响土壤重金属的生物有效性和吸附解吸过程，还能与根际微生物相互影响[41]。本研究中甜高粱根际水溶性糖含量高于黑麦草，S.melilotiD10菌株可以显著提高甜高粱根际水溶性糖含量，而且植物根际水溶性糖含量与植物干重、Cu含量和总量极显著正相关，与陈生涛等[42]的研究结果相似，说明D10菌株与甜高粱相互适应，水溶性糖含量的增加有助于甜高粱生长和吸收富集Cu。

土壤酶是土壤有机体的代谢动力，对环境因素的变化较敏感，其中脲酶活性对土壤Cu污染最为敏感，蔗糖酶其次[43]。本研究中植物根际脲酶活性与植物干重、Cu总量显著正相关，推测接菌处理提高土壤酶活性，缓解Cu污染对土壤酶活性的抑制作用，从而促进植物生长和富集Cu。

本研究中供试能源植物根系丰富，而盆栽试验容器较小，土壤受植物根系和接种D10影响较大，D10菌株能够改善能源植物根际土壤有效态Cu含量、水溶性糖含量和土壤脲酶活性，促进能源植物生长和富集Cu。进一步开展能源植物根际环境中重金属-根系分泌物-根瘤菌相互作用研究，将深化污染土壤植物修复领域的机理性认识。另外，在实际应用中也要充分考虑根际效应和菌株与植物的匹配关系，探讨根瘤菌强化能源植物修复重金属污染土壤的规模化应用效果。

4 结论

从紫花苜蓿根瘤中分离筛选到耐铜铅镉的苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)D10菌株。在铜矿废弃地土壤上，D10菌株能够促进紫花苜蓿和甜高粱生长，增加紫花苜蓿和甜高粱根对Cu的吸收，尤其是甜高粱对Cu的总富集量显著增加。D10菌株能够改善能源植物根际土壤有效态Cu含量、水溶性糖含量和土壤脲酶活性，促进能源植物生长和富集Cu，具有应用于铜矿废弃地植被恢复和联合修复污染土壤的潜力。