鸡粪及其配施尿素对甜瓜香味物质、酶活性及基因表达的影响

靳亚忠, 陈业雯, 陆 淼,张 森, 兰 慧，何淑平, 齐红岩

(1.黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，黑龙江 大庆 163319；2 .沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 110866)

薄皮甜瓜(Cucumismelovar.makuwaMakino)，一种重要的甜瓜栽培品种类型，其成熟果实香味浓郁、脆甜多汁、口感优良，是一种良好的消暑水果，深受消费者的喜爱。香味物质是衡量甜瓜风味品质的重要指标之一，且果实中香味的浓烈程度受挥发性物质的种类、含量和组成的影响[1-5]。甜瓜果实香味物质主要包括酯类、醇类、醛类、酮类、酸以及含硫化合物等[3,5-6]。许多研究已表明薄皮甜瓜成熟果实中主要呈香物质是酯类物质，其中乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸正己酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸苯甲酯、2-甲基丁酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸-2-甲基丙酯等为其果实特征性香气物质[1-2,4]。此外，甜瓜品种、果实成熟度、果实部位、嫁接以及外源物质等影响了果实中香气物质的种类、含量及其组分比例，进而导致了香味的差异[3-4,7-9]。在番茄[10-11]、桃[12-15]、蓝莓[16]、烤烟[17]中的研究也表明外源物质处理、贮藏、栽培措施、光质、施肥等措施促进或抑制了果实或烟草中香气物质的合成。

甜瓜属于喜肥作物，对氮、钾的需求量较多，但是在设施栽培中，一定的氮肥施用范围内，氮肥可以提高甜瓜果实产量，而过量施用氮肥却降低了产量以及可溶性糖分含量、Vc等品质指标[18]；此外，潜宗伟等[19]研究发现水培营养液中100%氮素用量处理的甜瓜果实中乙酸丁酯、乙酸-2-甲基丙基酯和2-甲基丁酸乙酯等特征性香气物质含量最高，但随着氮素用量的增加，这些特征性酯类物质含量则有所降低。在烟叶中也发现，氮肥过量施用降低了相同节位叶片中特征性香味物质——茄酮和新植二烯的含量[17,20]。为了提高生产中的肥料利用以及果实品质，国家实行了减肥减药的战略计划，利用有机肥进行化学氮肥的替代是策略之一。在红富士苹果栽培中，有机肥替代化肥使用，提高了果实中特征香气物质——乙酸己酯、丁酸己酯、丁酸-2-甲基己酯的含量，并促进了(S)-2-甲基-1-丁醇和(E )-2-己烯醛的合成，提高了苹果风味品质[21]；在鸭梨栽培中，施用有机肥提高了果实总糖和总酸含量，也提高了果实中香气物质种类和含量，尤其是特征性香气物质——乙酸己酯、丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、α-法尼烯的含量，且赋予了果实果香味[22]。有机肥改变了桃果实香气物质种类和含量，尤其是提高了特征性香气物质——内脂的种类和含量，降低了C6醇类和醛类物质合成，促进了果实甜香味和果香味的形成[23-24]，鸡粪的使用促进了肥城桃果实特征性酯类——乙酸丙酯、甲酸甲酯、乙酸己酯和丙酸甲酯的合成[24]。此外，利用有机肥替代化学氮肥提高了烟叶特征性香味物质——新植二烯、法尼基丙酮、茄酮、苯乙醇的含量[25]。由此可知，有机肥的使用可以改变果实香气物质的种类、含量以及组分比例，进而影响果实的香味，但是有机肥是如何通过香气物质代谢途径调节其合成，鲜有报道。在甜瓜果实中，许多研究已经表明甜瓜果实香气物质的合成与脂氧合酶(LOX)、氢过氧化物裂解酶(HPL)、乙醇脱氢酶(ADH)、醇酰基转移酶(AAT)、氨基转移酶等酶活性及其基因家族成员相关[9,26-31]，但是有机肥如何影响香气物质代谢途径中关键酶活性及酶基因的表达，进而调控香气物质的合成，还未见报道。因此，本试验研究采用基质栽培的方式，以薄皮甜瓜“DX108”为试材，研究鸡粪替代或与尿素配施对甜瓜果实香气物质合成的影响，旨在探讨鸡粪调控甜瓜果实香气物质合成的可能生理机理，为有机肥替代化学氮肥在甜瓜优质绿色栽培中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

盆栽试验采用基质栽培的方式进行，基质为草炭∶河沙=3∶1比例配置的混合基质，每桶装填10 kg基质。供试薄皮甜瓜为黑龙江八一农垦大学园艺系甜瓜课题组繁育的“DX108”自交系品种(花后30～33 d成熟)，采用穴盘进行育苗，当幼苗长出第4片真叶时，选取生长大小基本一致、无病虫害的幼苗定植于桶中进行种植，每桶定植1株甜瓜幼苗。

供试肥料为常规肥料：尿素(含N为46%)、含磷(P2O5)46.0%和含N 21.2%的磷酸二铵和含钾(K2O)34.3%的硫酸钾；试验用鸡粪为商品鸡粪：含全氮1.46%，含磷(P2O5)0.74%，含钾(K2O) 0.75 %，由黑龙江牧康牧业有限公司提供。

1.2 试验设计

试验设置为对照(CK)为化学肥料处理(纯N 600 mg·kg-1、P2O5300 mg·kg-1和K2O 300 mg·kg-1)，该处理中尿素用量为10 g·pot-1、磷酸二铵用量为6.52 g·pot-1、硫酸钾用量为8.74 g·pot-1；A处理为纯N 300 mg·kg-1+鸡粪(纯N 300 mg·kg-1)，其中鸡粪的用量为205 g·pot-1，尿素的用量为5.04 g·pot-1，磷酸二铵的用量为3.22 g·pot-1，硫酸钾的用量为4.26 g·pot-1；B处理为鸡粪处理，所用鸡粪的量根据纯N 600 mg·kg-1来计算，其用量为410 g·pot-1，且鸡粪中含磷(P2O5)为303 mg·kg-1,含钾(K2O)为308 mg·kg-1，与CK处理中肥料的总磷、总钾用量相接近，因此该处理没有额外添加磷酸二铵和硫酸钾。在桶中填混合基质时，CK处理50%的氮、磷、钾肥料以基肥的形式混合到土中，其余的肥料再平均分成2份，分别在甜瓜植株伸蔓期和果实坐果后进行追施；A和B处理所用到鸡粪以及磷钾肥，在装填桶时与基质混合均匀，装填入桶中。每个处理18桶，3次重复，每个重复6个桶，按照随机区组方法进行排列，放置于黑龙江八一农垦大学园艺园林学院实验基地的塑料大棚中进行栽培，各处理浇水、病虫害防治都按照统一的管理方式进行。甜瓜植株按照单蔓整枝方式进行管理，子蔓结瓜，瓜前留1片叶进行摘心。在甜瓜果实开花当天进行人工授粉，并挂标签进行标记，分别在花后果实生长的第20、25、30、35 d进行甜瓜果肉样品采集，样品放置于-40℃和-80℃冰柜中进行贮藏，用于各项指标的测定。

1.3 测定项目与方法

香气物质测定：采用顶空固相微萃取(SPME) 技术提取不同处理薄皮甜瓜果实香气成分，经气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 进行测定分析，参照齐红岩等采用的检测方法进行测定[9]。

香气物质合成关键酶活性测定：LOX酶活性、氨基转移酶、ADH酶以及AAT酶活性参照李岩的方法进行测定[7]。

实时荧光定量基因表达分析：果实组织总RNA的提取按照ultrapure RNA Kit(北京康为世纪生物科技有限公司，北京)试剂盒中提供的操作方法进行。获得的RNA用RNase-free 无菌水30μL进行溶解，并用DNAse I (Promega, Madison, WI, USA)在37℃下处理50 min，去除基因组DNA污染，并进行重新沉淀和浓缩。qRT-PCR采用反应体系为20 μL，采用的试剂盒为SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(Cat.FP205,天根,北京,中国)，并使用ABI PRISM7500荧光定量PCR仪进行测定。qRT-PCR的反应条件如下：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，45个循环，15 s；60℃，1 min；每个样品的qRT-PCR都进行3次重复，cDNA来自3个生物学重复的样品。试验中以18SrRNA DNA (148 bp)作为内参基因，ADH基因和AAT基因家族成员表达引物见表1，样品Ct值是由扩增曲线计算获得的。

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2010和SPSS.19软件对数据进行处理和统计分析，采用Duncan 新复极差法进行显著性分析，Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实香气物质种类及含量的影响

由表2可以看出，薄皮甜瓜果实中香气物质主要由醇类、醛类、酯类、酸类物质组成，且随着果实的发育这些香气物质种类以及总含量发生变化，不同施肥处理的果实之间存在显著差异(P<0.05)。尿素单独处理(CK)果实中，随着果实发育，醇类、醛类、酯类、酸类物质种类逐渐增多；鸡粪+尿素(A)和鸡粪(B)处理的果实中酯类物质种类逐渐增多，而醇类、醛类种类减少。对于这些香气物质总含量而言，在各个时期尿素(CK)处理的甜瓜果实中香气物质主要以醇类和醛类物质为主，酯类物质次之，尤其是C6+C9醇类和醛类物质含量明显高于鸡粪+尿素以及单独鸡粪处理(图1)；而鸡粪+尿素(A)和鸡粪(B)处理的果实中香气物质则以酯类物质为主，醇类和醛类次之，尤其是乙酸酯类物质含量显著高于CK(图1)。此外，在尿素(CK)单独处理的甜瓜果实中酯类物质总含量随着果实发育呈现先升高而后降低的现象，而其它两个处理果实中酯类物质总含量则呈现逐渐升高的趋势，且在果实成熟的后期(30 d和35 d)，鸡粪+尿素(A)处理的果实中酯类物质总量明显高于鸡粪(B)处理的果实中酯类总含量(P<0.05)。

2.2 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中主要酯类物质含量的影响

表3中列出的为果实中含量较高和因施肥处理不同而变化强烈的酯类物质，其中包含一些甜瓜果实特征性酯类物质。由表3可知，乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯是薄皮甜瓜果实中含量较高的酯类物质，随着果实发育，其含量呈现增加趋势，但是鸡粪+尿素(A)处理果实中2-甲基丁基乙酸酯含量先升高而后降低。总体来看，与鸡粪+尿素以及鸡粪单独处理相比较，单独尿素处理(CK)的甜瓜果实中没有检测到2-甲基丁酸甲酯、2-乙基丁酸乙酯、乙酸香叶酯、甘油亚麻酸酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、正癸酸正癸酯、水杨酸甲酯；只在花后30 d或35 d的果实中检测到丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、异丁酸丁酯、辛酸乙酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯，且含量较低。鸡粪+尿素和鸡粪处理明显提高了花后30 d或35 d果实中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯甲酯、甘油亚麻酸酯、乙酸异丁酯、异丁酸丁酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯的含量，尤其是鸡粪的施用显著促进了甜瓜特征性香气物质乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、乙酸苯甲酯、乙酸异丁酯、己酸乙酯含量的增加。

表2 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中香气物质种类和含量的影响

图1 不同施肥处理对薄皮甜瓜成熟果实中乙酸酯类、非乙酸酯类、C6+C9醇类和醛类含量的影响Fig.1 Effects of different fertilization treatments on the contents of acetate esters, non-acetate esters,C6+C9 alcohols and aldehydes in melon ripe fruits

2.3 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中香气物质合成相关酶活性的影响

由图2可知， 花后20 d时，各处理之间LOX酶活性差异不显著，但在25 d之后，鸡粪+尿素(A)和鸡粪(B)处理甜瓜果实中LOX酶活性迅速升高，在30 d时达到峰值，之后又降低，且显著高于单施尿素处理(CK)(P<0.05)。鸡粪单独处理果实中氨基转移酶活性始终高于单施尿素处理，在35 d的果实中处理之间差异显著(P<0.05)；而鸡粪(B)与鸡粪+尿素(A)处理之间相比，只在花后20～30 d期间和35 d果实中氨基转移酶活性呈现差异(P<0.05)。此外，单施尿素处理(CK)与鸡粪+尿素(A)处理甜瓜果实中氨基转移酶的活性，仅在花后35 d差异显著(P<0.05)。

ADH和AAT酶是果实中酯类香气物质合成途径中下游的关键调节酶。由图2可知，等氮量条件下，在花后20 d，单施尿素(CK)处理甜瓜果实中ADH酶活性显著高于鸡粪(B)以及鸡粪+尿素(A)处理(P<0.05)。随着果实的发育，尿素处理果实中ADH酶活性呈现出先降低而后升高的趋势，而鸡粪(B)以及鸡粪+尿素(A)处理果实中ADH酶活性逐渐升高，在花后30 d时达到峰值，之后降低，且在花后30 d时，ADH酶活性稍高于尿素；但在花后35 d时，则显著低于尿素(CK)处理(P<0.05)。此外，3种处理甜瓜果实中AAT酶活性，随着果实发育都显示出先升高，在花后30 d时达到峰值，之后呈现降低的趋势。鸡粪(B)、鸡粪+尿素(A)处理果实中AAT酶活性在花后30 d时显著高于单施尿素(CK)处理(P<0.05)，在花后35 d时，鸡粪+尿素(A)处理果实AAT酶活性明显大于单施尿素(CK)和鸡粪(B)处理，而单施尿素(CK)与单施鸡粪(B)处理之间果实中AAT活性无显著差异(P<0.05)。

2.4 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中香气物质合成相关酶基因表达的影响

由图3可知，甜瓜果实中CmADH1和CmADH2的表达量随着果实发育呈现出逐渐升高的趋势，且处理之间差异显著(P<0.05)。尿素单独处理(CK)促进了花后30 d和35 d甜瓜果实中CmADH1和CmADH2的表达，这2个基因的表达量显著高于鸡粪(B)和鸡粪+尿素处理(A)(P<0.05)。鸡粪+尿素(A)处理增加了花后20 d和25 d果实中CmADH1的表达量，而鸡粪(B)处理提高了花后20 d和25 d果实中的CmADH2的表达量(P<0.05)。

尿素、鸡粪以及鸡粪+尿素处理对CmAAT1、CmAAT2和CmAAT3表达的影响也存在差异(图4)。尿素处理(CK)减弱了CmAAT2和CmAAT3在果实中的表达，而鸡粪+尿素(A)以及鸡粪(B)处理显著促进了CmAAT3基因在花后20～35 d果实中的表达，且鸡粪+尿素(A)处理提高了CmAAT1和CmAAT3在花后30 d和35 d果实中的表达水平，而且显著高于尿素(CK)和鸡粪(B)单独处理(P<0.05)。

表3 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中主要酯类香气物质含量的影响

3 讨 论

有机肥在果蔬上的施用对果菜品质具有重要的作用，在提高果蔬品质方面的效果已被证实。有机肥可以提高肥城桃果实中可溶性固形物、Vc、固酸比、蔗糖和总糖含量以及桃果实中特征性香气物质含量和种类，赋予了果实果香和甜香味[23-24]；在苹果[21]、香蕉[32]、鸭梨[22]的栽培中也发现，施用有机肥提高了果实中“酯香型”和“果香型”酯类物质含量，同时也增加了酯类物质种类，且鸡粪的施用促进了肥城桃果实中特征性酯类——乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸甲酯、乙酸己酯和丙酸甲酯的积累[25]，这与本文的研究结果相似。本文详细分析了鸡粪、鸡粪+尿素以及尿素处理对薄皮甜瓜香气物质合成的影响，发现鸡粪、鸡粪+尿素处理降低了果实中C6和C9醇、醛的种类和含量，而促进了“酯香型”物质——丁酸乙酯、乙酸乙酯含量的增加，提高了果香型物质——丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的含量，赋予了甜瓜果实浓郁的酯香味和果香味；而单独尿素处理果实中C6和C9醇、醛的种类和含量显著高于鸡粪以及鸡粪+尿素处理，因此果实呈现出了青香味。另外，本研究还发现鸡粪+尿素处理成熟果实中酯类物质的种类和含量高于鸡粪单独处理，同时也发现2-乙基丁酸乙酯、乙酸香叶酯和水杨酸甲酯只在鸡粪处理果实中测出，而丁酸戊酯和异丁酸乙酯仅在鸡粪+尿素处理的果实中测出，因此这些酯类物质种类和含量的差异导致了果实香味的差异。在烟草中，有机肥的使用也促进了烟叶中特征性香气成分新植二烯、法尼基丙酮、茄酮、苯乙醇的含量，改变了烟草风味[17]。由此可知，有机肥——鸡粪的施用主要是通过调节果实中酯类物质，尤其是特征性“酯香型”和“果香型”物质种类和含量而改变薄皮甜瓜果实香味品质的。

图2 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实香气物质合成关键酶活性的影响Fig.2 Effects of different fertilization treatments on the activities of enzyme responsible for aromas synthesis in fruits of oriental melon

图3 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中CmADH1和CmADH2基因表达的影响Fig.3 Effects of different fertilization treatments on the expressions of CmADH1 and CmADH2 in fruits of oriental melon

图4 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中CmAAT1、CmAAT2和CmAAT3基因表达的影响Fig.4 Effects of different fertilization treatments on the expressions of CmAAT1, CmAAT2 and CmAAT3 in fruit of oriental melon

已有研究表明，薄皮甜瓜果实中香气物质的合成积累与其合成途径中LOX酶、氨基转移酶、ADH酶、AAT酶活性以及关键限速酶基因表达相关[26,28-29,33-34]。在薄皮甜瓜中，嫁接方式降低了成熟果实中脂氧合酶(LOX)、醇脱氢酶(ADH)和醇酰基转移酶(AAT)的活性，还降低了CmADH1和CmADH2以及CmAAT1和CmAAT2的转录水平，进而影响了果实中香气物质的种类和含量，尤其是特征性酯类物质种类和含量[9,35]。李映晖等[32]研究表明，增施鱼粉提高了香蕉和粉蕉果实中醇脱氢酶(ADH)和醇酰基转移酶(AAT)活性，且与果实挥发性物质总量和种类的增加呈现明显的相关性。在本研究中发现，鸡粪部分替代和全替代化学氮肥条件下，明显提高了花后30 d和35 d果实中LOX酶活性、氨基转移酶活性、AAT酶活性以及25～30 d期间ADH酶活性；尿素明显促进了30 d后果实中CmADH1和CmADH2基因的表达水平，而鸡粪以及鸡粪与尿素配施处理促进了30 d或35 d果实中CmAAT1、CmAAT2和CmAAT3的表达水平，与果实中酶活性变化不完全一致，可能果实中还存在其它家族成员参与了果实中相对应酶活性的调节[26,28]。同时依据甜瓜果实中香气物质的种类和含量变化，发现尿素处理促进了CmADH1和CmADH2转录丰度的提高，可能是该处理甜瓜果实C6和C9醇醛类物质较高的原因之一。因此，鸡粪以及鸡粪与尿素配施可能是通过调节果实发育期间香气物质合成关键酶活性之间的相互协调作用，以及调节关键限速酶基因CmADH和CmAAT家族成员的转录水平，影响了香气物质的合成，尤其是促进了酯类物质合成的限速酶——AAT酶活性及CmAAT基因家族成员在不同时期的表达，进而调节了酯类物质的合成，提高了果实香味品质。但是，有机肥——鸡粪的施用是如何通过一个调控网络调节香气物质合成的分子机制还不清楚，需进一步进行探讨。

国内外许多研究已经证明，在化学氮肥减量的情况下，有机肥或生物有机肥的施用能够明显促进土壤脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶、中性磷酸酶、蛋白酶等土壤酶活性的提高[36]以及土壤有益菌群数量、有效养分、腐殖酸以及有机质含量的增加，提高了土壤肥力和生物活性[37-39]，改善了土壤氮的代谢特性，进而改善了果实风味品质[40]。但是，有机肥是如何通过调节土壤-植物-微生物的互作进而调节果实品质的机理还不明确。Gaudinier 等[41]研究发现氮的吸收、运输、代谢以及提高氮素有效性的分子调控网络中包含有转录因子、氮素和氨基酸代谢途径、碳代谢途径以及激素信号途径中的关键基因、Ca2+受体蛋白激酶等，因此，有机肥以及有机肥与化学氮肥的配施可能是通过氮信号、糖信号或激素信号的传递，启动了转录因子对甜瓜植株体内氮素代谢途径关键酶基因的表达调控，从而引发植物体内香气物质代谢网络发生变化，促进了甜瓜果实中香气物质的合成。这种推测还需通过分子生物技术、生物化学等方法进一步验证。

4 结 论

尿素、鸡粪以及鸡粪+尿素处理对薄皮甜瓜果实香气物质合成的影响不同；尿素的施用显著提高了果实中C6、C9醇醛物质含量和种类，而鸡粪、鸡粪+尿素的处理则促进了酯类物质合成和种类的增加，尤其是“酯香型”和“果香型”酯类香气物质的含量，而鸡粪和尿素的配施对成熟果实中乙酸酯类和非乙酸酯类特征性香气物质的影响较大。鸡粪以及鸡粪和尿素配施是通过调节果实香气合成相关酶活性之间相互协调作用，调节了香气物质的合成，另一方面，还从转录水平促进了酯类香气合成关键酶基因的表达量，最终影响了果实的香气成分变化和香味品质。